[发明专利]一种发酵法制备棘白菌素B的方法及菌株

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一株构巢曲霉菌突变株——构巢曲霉（Aspergillus nidulans）ZJB09223，以及利用所述的构巢曲霉ZJB09223发酵法制备棘白菌素B的方法。

（二）背景技术

棘白菌素B(Echinocandin B)是一种具有环状六肽核心和脂肪酸侧链结构天然环状脂肽类化合物。化学名是，分子式为C₅₂H₈₁N₇O₁₆，分子量为1060，结构式如下：

近年来，由于器官移植手术导致免疫抑制剂的大量使用，化疗和更具侵袭性的医疗方法的应用等多种原因造成免疫低下患者增多，真菌感染发病率显著升高，尤其是深部真菌感染的发病率和病死率逐年增加。棘白菌素类抗真菌抗生素是由相似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链组成，是临床治疗系统性真菌感染的新一代抗真菌药物。这类抗生素能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性。其作用机制独特，毒副作用低，且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具有很强的抗菌活性，尤其是对诸如曲霉和白念珠菌等呈现上升趋势的真菌具有独特的疗效。目前已经有3种棘白霉素类药物上市，即默沙东公司开发的卡泊芬净（caspofungin），藤泽药业开发的米卡芬净（micafungin），以及辉瑞公司开发的阿尼芬净（anidulafungin）。

阿尼芬净（anidulafungin）具有抗各种念珠菌病的活体内和活体外活性的功效。在2005年的ICAAC会议上发表的研究表明：阿尼芬净与氟康唑比较用于治疗念珠菌血症和侵入性念珠菌病。患者被随机接受静脉注射的阿尼芬净100mg/d或静脉注射的氟康唑400mg/d。在10或更多天的静脉注射治疗后，任一组的患者被转到口服的氟康唑。研究结果证明接受阿尼芬净患者的整体成功率高于使用氟康唑的患者。2006年2月21日，由辉瑞公司生产的阿尼芬净通过了美国FDA认证，用于治疗食管感染和其他形式的念珠菌感染。

目前，国外生产阿尼芬净的路线，首先由构巢曲霉（Aspergilus nidulans）发酵形成先导化合物棘白菌素B，通过脱酰基酶酶解除掉侧链，然后经过化学修饰获得。但是由于棘白菌素B发酵单位较低等多种因素，造成阿尼芬净生产难度大、成本高，从而导致价格高昂且产量远远不能满足国际市场的需求，是国际市场紧缺的医药原料之一。

由于商业利益的原因，国外的一些菌种和工艺等关键技术对外保密，很少公开报道。美国礼来公司自从上世纪80年代以来，进行多年的棘白菌素B发酵工艺条件优化和产物提取工作，但发酵产量一直没有较大突破。在国内，尽管已有制取棘白菌素B的菌种，但是该菌株制取棘白菌素B的能力较弱，效能低。因此，选育出一株高产棘白菌素B的菌株对实现棘白菌素B产业化生产具有较大的社会和经济效益。

（三）发明内容

本发明目的是提供一株棘白菌素B的高产菌株，以及采用该菌株发酵法制取棘白菌素B的方法，以克服现有棘白菌素B发酵技术中发酵周期长、单位产量低的缺陷。

本发明采用的技术方案是：

一株构巢曲霉菌突变株——构巢曲霉（Aspergillus nidulans）ZJB09223，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCC NO：M 2012300，保藏日期为2012年07月25日。本发明突变株用于发酵制备棘白菌素B，发酵单位可达到3000mg/L以上。

本发明突变菌株由如下步骤获得：

1)对构巢曲霉Aspergillus nidulans（ATCC58397）进行LiCl/紫外/亚硝酸钠复合诱变处理，涂布斜面，培养，得诱变处理突变株；

2）分别将步骤1）所得的突变株斜面培养物制备孢子悬液，涂布含有棘白菌素B的固体平板，培养，即得耐受棘白菌素B的构巢曲霉菌；

3）分别挑取步骤2）所得耐受棘白菌素B的构巢曲霉菌单菌落进行摇瓶发酵培养，检测发酵物中的棘白菌素B产量，选择棘白菌素B高产菌株，得到了Aspergillus nidulans突变菌株ZJB09223。

本发明还涉及一种利用所述的构巢曲霉ZJB09223发酵法制备棘白菌素B的方法，所述方法包括：

（1）种子培养：将构巢曲霉ZJB09223接种至种子培养基，25～30℃培养24～48h，获得种子液；所述种子培养基组成如下：葡萄糖0.5～1.5%，甘油0.5～5%，棉籽粉1～10%，溶剂为蒸馏水，pH值自然；