[发明专利]柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

a、采用甲醛灭活的方法制备病原菌颗粒性抗原；

b、取a作为抗原，与弗氏完全佐剂等体积混合，免疫健康白兔；

c、两周后取a与弗氏不完全佐剂等体积混合，对b中白兔采用同样方法进行二次免疫，采用间接ELISA法监测抗血清效价，并按每隔两周免疫一次的方式进行第三、四次免疫，第四次免疫两周后单独用颗粒性免疫原冲击免疫一次；

d、收集白兔血液，分离抗血清；

e、纯化抗血清，得到目标多克隆抗体，并鉴定其蛋白含量、效价及特异性；

步骤a中的病原菌为柱状黄杆菌G_4R3，为柱状黄杆菌的代表类群。

2.根据权利要求1所述的柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤a中颗粒性抗原的制备方法为：取穿刺菌种接种至胰胨液体培养基中，27℃摇床活化24h；将活化后的菌液做平板划线分离；单克隆菌落转接至100ml胰胨液体培养基中增菌；菌液用新鲜配制的液体培养基做适当梯度稀释，采用分光光度法法测定各稀释度菌液的OD₆₀₀值，结合平板菌落计数法计数菌液浓度，制备活菌数与OD₆₀₀值的标准曲线，根据标准曲线计算菌液浓度将扩增的菌液离心，并用无菌生理盐水洗脱，弃上清，反复2次，离心收集菌体；生理盐水重悬，并于重悬菌液加入0.5%的甲醛4℃灭活24h，制备柱状黄杆菌颗粒性抗原；24 h后将灭活菌液离心弃上清，沉淀用灭菌生理盐水洗涤3次，调整菌液浓度。

3.根据权利要求1所述的柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤a中用于培养柱状黄杆菌的培养基为胰胨培养基，培养条件为：27℃培养24-36h，其中胰胨培养基：0.5‰胰蛋白胨，0.2‰牛肉膏，0.5‰酵母浸粉，醋酸钠0.2‰，1 moL/L NaOH调pH至7.2-7.4，高压灭菌20min。

4.根据权利要求1所述的柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤b中，实验动物为2kg健康雄性新西兰白兔；免疫方法采用背部脊柱两侧皮下5点注射免疫，免疫剂量为0.5×10⁹cfu/只。

5.根据权利要求1所述的柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤b和步骤c中，采用的是漩涡震荡乳化剂逐滴加入颗粒性抗原的方法：取灭菌的青霉素瓶，按需要量加入弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，盖好灭菌胶塞，用漩涡震荡器使之高速旋转，用灭菌注射器吸取与佐剂等体积的颗粒性细菌抗原逐滴加入佐剂中，可见抗原液滴入后在佐剂中呈球状并逐渐变小消失；抗原溶液全部加完后再涡旋15 min，采用滴入静止的冷水液面5 min不扩散的方法检测是否制成油包水的乳剂；由于液体在漩涡震荡过程中会释放大量热量，为较好的保存抗原性，青霉素瓶每震荡5min后置于冰浴中1min。

6.根据权利要求1所述的柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤c中，为获得高效价的抗体，还应在每次免疫完一周后耳缘静脉采血检测血清抗体效价，当抗体效价达到最大值时，可以分离免疫动物血清。

7.根据权利要求1所述的柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：间接ELISA检测法，包括如下步骤：

a.用颗粒性抗原包被酶标板，洗板；

b.用含3%牛血清白蛋白的PBST封闭包被的酶标板，洗板；

c.加待检血清或抗体，洗板；

d.加酶标二抗，洗板；

e.加底物OPD显色；

f. 2 mol/L硫酸终止反应；

g.用酶联免疫检测仪在波长492nm处，读吸光值。

8.根据权利要求1所述的柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤e中，抗血清的纯化方法采用辛酸-硫酸铵法纯化，具体操作如下：在收集的抗血清中加入4倍体积的0.06 mol/L pH 4.0的醋酸缓冲液，用0.1mol/L NaOH调pH至4.8；

电磁搅拌下缓慢滴入正辛酸至终浓度为33μL/mL以沉淀非IgG蛋白，继续磁力搅拌30min后，4℃静置2h，12000rpm离心30 min，除去沉淀；

取上清并加入1/10体积的0.1mol/L PBS，用2mol/L NaOH小心调节pH至7.4，在4℃冰浴下加入硫酸铵至终浓度为0.277g/mL，搅拌30min，4℃静置2h, 10000rpm离心30 min；

弃上清，将沉淀溶于0.2mL 0.01mol/L PBS中，用0.01mol/L PBS于4℃透析过夜，期间每 3～4h换液一次，之后于4℃ 5000g离心20min，去除不溶性沉渣，上清用PBS 稀释至纯化前相同体积，于-20℃冻存。