[发明专利]检测结直肠癌及其恶性程度的免疫组化试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及结直肠肿瘤免疫诊断试剂盒，尤其涉及用于诊断结直肠肿瘤及判断其恶性程度的免疫组化试剂盒。

背景技术

 S100蛋白是由小分子量蛋白（10-14 kDa）组成的钙结合蛋白家族，因其在中性 pH 条件下能溶解于 100% 饱和度硫酸铵中而得名。研究发现，此类蛋白仅在脊柱动物中表达，目前已发现23种S100 蛋白家族成员。S100A9蛋白是S100 蛋白家族的重要成员，具有S100 蛋白家族特征性的保守EF 手型结构和4-螺旋环形，与Ca²⁺、Zn²⁺及Cu²⁺等不同金属离子结合发生结构变异，暴露与靶蛋白的结合位点进而通过与相应的效应靶蛋白相互作用参与系列反应。其主要在粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞中高表达，通常与S100A8蛋白共表达形成异二聚体—S100A8/9钙卫蛋白，结合TLR4、RAGE、CD36和细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）等受体后激活NF-κB、AP-1及其他转录因子，参与急慢性炎症反应、免疫调节、肿瘤生长、增殖及侵袭转等系列生物学效应。国内外目前虽有研究表明S100A9与肿瘤相关，但对于S100A9与特定类型肿瘤细胞发生发展的关系，以及其应用于特定类型肿瘤的诊断与治疗，尚缺少研究。

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是消化道常见的恶性肿瘤，据2008年国际癌症机构（IARC）研究统计，世界范围内每年约有一百万人发生结直肠癌，全球结直肠癌死亡率占肿瘤总死亡率8%，肿瘤致死率排名第四，且我国结直肠癌病死率高达45.5%，而结直肠肿瘤的恶性程度与肿瘤致死率密切相关。因此，寻找一种对结直肠癌进行诊断并对其恶性程度进行判断的方法至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结直肠癌诊断及恶性程度判断的S100A9免疫组化检测试剂盒，通过该试剂盒可以方便快捷地检测样本结直肠病理组织表面S100A9抗原的表达水平，从而可以为结直肠癌诊断及其恶性程度的判断提供帮助。

为达到上述发明目的，本发明提供的诊断试剂盒包含：内源性过氧化物酶阻断剂、非特异性结合位点阻断剂、一抗、二抗、酶、显色剂；其中一抗为人源抗S100A9 单克隆抗体或鼠源抗S100A9 单克隆抗体，二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。

本发明中，常规各种用于免疫组化试验的内源性过氧化物酶阻断剂、非特异性结合位点阻断剂、酶、显色剂均可用于本发明试验盒，但作为最佳选择，内源性过氧化物酶阻断剂为3wt% H₂O₂；非特异性结合位点阻断剂为动物非免疫血清，其中优选非免疫羊血清；酶优选链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶；显色剂优选DAB显色剂，包括：DAB缓冲液（20×），DAB底物（20×），DAB色原（20×）。

更进一步地，作为本发明试剂盒的优化，还可以在试剂盒中设置用于参照的比对色卡，以方便对待测样本的染色结果进行比对，或者设置对待测样本切片中染色细胞百分数进行计算的计数器，以便于对样本染色结果做快速分析。

 发明人通过研究发现：S100A9在结直肠癌中的表达水平明显高于正常结直肠组织，并且，S100A9蛋白的表达水平在不同分化程度结直肠癌组织中表达强度存在显著差别，高、中、低分化结直肠癌组织中，S100A9蛋白表达的强阳性率呈明显递增趋势，即分化程度越低，强阳性表达水平越高，分化程度越高，表达水平越低。因此，检测受试者结直肠组织表面S100A9的表达水平，可以作为结直肠癌的恶性程度诊断的分子标志物。因此，发明人提供上述免疫组化试剂盒，利用该试剂盒，通过检测结直肠病理组织表面S100A9抗原的表达，能快速准确地判断结直肠癌恶性程度的临床诊断提供帮助。试剂盒中设置比对色卡和染色细胞计数器，能方便对染色结果做快速准确地分析，提高试剂盒的易用性和方便性。

附图说明

图1：NCBI GEO DataSets系列GSE37364中探针203535_at所对应的S100A9在38例正常结直肠组织和27例结直肠癌组织的RNA表达结果图。

图2：免疫组化检测正常结直肠组织及高、低分化结直肠癌组织中S100A9蛋白的表达结果图A-E图均为显微镜下放大200倍的组织结构图，其中：

A：正常结直肠组织阴性对照（未加S100A9一抗）；

B：结直肠癌组织阴性对照（未加S100A9一抗）；

C：正常结直肠组织；

D：高分化结直肠癌组织；