[发明专利]重组灵芝免疫调节蛋白与人血清白蛋白融合蛋白及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及重组融合蛋白的构建、表达、纯化与应用，具体涉及用于治疗化疗导致的白细胞较少症和肿瘤等症的重组灵芝免疫调节蛋白与人血清白蛋白融合蛋白的制备及其应用。

背景技术

灵芝免疫调节蛋白（LZ-8）源自于松杉灵芝的菌丝体，其结构特征如下：包括一个N端的形成二聚体所需的重要结构域和一个C端的FNIII结构域，rLZ-8的N-端结构域由一个α-helix和一个β-strand组成，LZ-8单体上的N端α-helix和β-strand与另一单体上相同的结构域通过空间交换形成了重要的二聚体结合结构域，呈哑铃状。已有文献报道LZ-8具有免疫调节（专利申请号201110222012.5）和杀伤肿瘤细胞（专利ZL200810050206.X）的生物学活性。

目前，造成蛋白类药物半衰期较短的原因主要有：①蛋白质水解是绝大多数蛋白质的代谢方式之一，机体组织中蛋白水解酶的存在会使蛋白质药物活性降低；②肾脏是小分子蛋白质分解代谢过程中最重要的器官，相对分子质量小于69000Da的绝大多数蛋白质分子都能通过肾小球滤过作用而被排出体外；③肝脏在蛋白质药物代谢过程中也具有重要作用，药物通过扩散和载体转运等形式被转运至肝细胞中，然后再被微粒体酶P450、胞液中的蛋白酶或溶酶体所降解；而对于更大分子的肽和蛋白质则是通过受体介导的内吞作用被肝细胞摄取后被降解。由于灵芝免疫调节蛋白二聚体分子量不足26kDa，可能造成体内清除率高，药代动力学参数难以满足其新药开发的要求，因此，通过基因水平融合等技术手段延长LZ-8在体内的作用时间，为其在临床治疗中的应用奠定坚实的基础。为了延长蛋白类药物的半衰期，近几年各国学者主要从蛋白类药物的白蛋白融合、化学修饰、微囊化、构建突变体、糖基化等方面进行研究。随着研究的不断深入和进展，长效蛋白药物的新品种不断涌现。

基因融合技术是将不同的基因连接起来从而表达具有复合功能的融合蛋白，通过基因融合技术增加多肽和蛋白药物分子量或改变药物与受体的亲和性等原理可以延长药物的半衰期。构建融合蛋白的原则为：将一个蛋白的编码基因的终止密码子去除，然后连接上带有终止密码子的另一个蛋白的编码基因，即实现两种蛋白的编码基因的融合，进而同时表达两种蛋白。融合蛋白基因稳定性高，可调控表达且制备简单，产物均一，对蛋白、多肽药物活性影响小等是目前研究长效多肽、蛋白药物的一种良好的途径。

目前研究的较为广泛的融合基因有人血清白蛋白基因、人免疫球蛋白（IgG1、IgG4）基因等。人血清白蛋白（Human Serum Albumin，简称HSA）是人血浆中的蛋白质，其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量为66kDa。在血浆中其浓度为42g/L，约占血浆总蛋白的60%。在体液中人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等；同时维持血液正常的渗透压。在临床上人血清白蛋白可用于治疗休克与烧伤，用于补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为血浆增容剂。

人免疫球蛋白（IgG）是人体血液中最丰富的蛋白，其半衰期可达21天。已有报道显示将IgG的Fc片段与其他蛋白融合，可显著增加其他蛋白在体内的生物活性和半衰期，其中大多数实验者选择IgG1、IgG4这两种亚型的Fc段作为融合对象，这种方法已经广泛应用于一些临床上很重要的细胞因子和可溶性受体，如sTNF-αR、LFA3、CTLA-4、IL-2、IFN-α等，并获得了成功。

    鉴于上述背景技术，本发明采用了基因重组技术将灵芝免疫调节蛋白分别与人血清白蛋白、人免疫球蛋白IgG的Fc段进行融合，构建真核表达体系，经过表达、纯化得到目的蛋白，并对目的蛋白进行了相关生物学活性与药学研究，结果表明灵芝免疫调节蛋白（LZ-8）与HSA融合蛋白在药学与生物学活性以及病理应用方面有明显差异。

发明内容

本发明的目的是提供重组灵芝免疫调节蛋白与人血清白蛋白融合蛋白及其制备方法，探讨其在治疗化疗药所致白细胞减少症等症及在抗肿瘤药物中的应用。