[发明专利]一种以手工二次离心法制备富血小板血浆的方法

说明书

技术领域

本发明涉及富血小板血浆的制备方法，具体地，涉及一种以手工二次离心法制备富血小板血浆的方法。

背景技术

富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是来源于人体的富集血小板细胞的血浆制品，其血小板细胞浓度标准最初由美国迈阿密大学Marx教授于2001年提出，他认为PRP中血小板浓度应为全血中血小板浓度的5倍以上。但大多研究者制备的PRP很难达到这个标准，而且他们在研究中发现，即使PRP中血小板浓度稍低于这个标准仍然能获得良好的治疗效果。在2011年加拿大学者Drew W.T.提出一个新的标准——PRP中的血小板浓度为全血中血小板浓度的3至5倍，这个标准得到大多数人的认可。

PRP的概念最早于1954年由Kingsley CS在《自然》杂志中提出，而PRP最初被分离制备得到并用于临床是在1977年，当时成功用于心外科手术患者，避免了体外循环期间血小板功能的损伤和术后出血。在1982年，DAVID R. KNIGHTON等人将从兔子自身静脉血分离得到的PRP注入其角膜，发现血小板能促进血管增生、胶原合成，从而使角膜混浊、增厚，结果提示血小板能促进组织增生。自此人们便致力于将PRP应用于临床，期望能解决组织、器官损伤后修复的难题。但由于当时PRP的制作工艺不完善，难以得到符合标准的PRP，因此限制了其临床研究。经过将近10年的探索，到了90年代，才制作出成分较为单一的PRP。从此，PRP在临床中逐渐推广与应用。经过几十年的研究，已探索出几种较为合适的PRP制备方法：手工法（一次离心法、二次离心法和三次离心法）及设备制备法。

已经有文献报道并被广泛认可的一次离心法有Anitua法，在1999年，西班牙Eduardo Anitua博士发明了此法，他当时采集患者10至20mL静脉血，加入5mL的离心管内，以160g离心力离心6分钟，然后弃取上层（贫血小板血浆层）1ml，再吸取剩余上层血浆至下层（红细胞层）1～2mm，这样5mL的静脉血大约可以获取1.2mL的PRP，遗憾的是，他当时并未对所获得的PRP进行成分分析，从而无从得知PRP中的血红蛋白量。

而二次离心法公开发表并被广泛用于研究的方法为Landesberg法。当时Landesberg博士等研究采集3个健康志愿者的静脉血，经以下多种方法离心：第一次离心以100g和200g离心力进行离心2分钟至20分钟，然后吸取血浆层（上层和中层）移至另外一个离心管中，进行第二次离心；第二次离心的离心力为100g、200g、250g及400g，时间为2分钟至10分钟，然后吸取弃去上层血浆，剩余的下层血浆即PRP。结果分析得到：第一次离心得到的上中层血小板浓度为全血的229%是最高的浓度，此时的离心方法为以100g离心力离心10分钟；进行第二次离心时，少于5分钟的离心时间得到的结果与全血中血小板浓度相比没有意义，但时间增加至10分钟时，200g及250g的离心力均能使得到的结果明显高于全血中血小板浓度，且得到最高浓度血小板的离心力为200g，而以400g离心力进行离心时则出现血小板膜的破坏。因此，制备出含有最高浓度血小板的PRP的二次离心方法为采用200g离心力进行离心10分钟，此即Landesberg法。

大多研究都表明：以二次离心法比一次离心法制备的PRP中血小板浓度要高，而在已有文献报道的二次离心法中，有研究者将它们进行了比较，结果认为Landesberg法是一种最优的方法，如袁霆、张长青用4种方法（Aniua法（一次离心160g×6min）、Petrungaro法、Landesberg法、Aghaloo法，后三者为2次离心）进行对照研究，比较不同方法制备的PRP中血小板计数，结果显示Anitua法制备的PRP中血小板计数较另外三种方法低，而最高的为Landesberg法。

目前虽能制备出成分较为单一、浓度达标的PRP，但其制备技术仍未完全成熟。因为从现今几种制备方法的探索过程来看，研究者均是主观地将离心力固定在几种上，如Landesberg法的探索过程，Landesberg博士就将离心力固定在100g、200g、250g及400g这几个上，而未曾对其他离心力进行研究，得出的结论只能是这几种离心力中能制备出血小板浓度最高的离心力。因此，用这种探索方法要想得到很好的离心力与离心时间的组合，必须要有大量的分组作为基础，得出的结论才有更大的说服力。因此，我们有理由怀疑，Landesberg法并非最好的离心方法。