[发明专利]小鼠卵巢表面上皮细胞体外自发恶性转化模型建立技术

说明书

技术领域

本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种小鼠卵巢表面上皮细胞体外自发恶性转化模型建立技术。 

背景技术

在女性生殖系统恶性肿瘤发病中，卵巢癌的病死率最高，其生存率仅为30%。其主要原因是卵巢癌的早期诊断率低，恶性程度高，易转移，并且治疗过程中易产生耐药性。虽然已有的研究表明大约80%-90%的卵巢癌起源于卵巢表面上皮细胞，但是对于卵巢表面上皮细胞恶性转化的病因及其病理学过程目前尚不清楚。为了更深入掌握上皮细胞性卵巢癌的发生和病理学发展机制，需要了解卵巢表面上皮细胞恶性转化的过程，并建立一个小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化的研究模型。 

发明内容

为克服现有技术中的不足，本发明提供一种小鼠卵巢表面上皮细胞体外自发恶性转化模型建立技术。 

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现： 

小鼠卵巢表面上皮细胞体外自发恶性转化模型建立技术，包括以下步骤：

a．小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶转化阶段

步骤1）原代小鼠卵巢表面上皮细胞：首先在超净台下，取4只6 - 8 周龄未生育过的健康雌性C57BL/6小鼠的卵巢，放置在含400 IU/ml 青霉素、链霉素的PBS（1000 ml 双蒸水, NaCl 8.0 g, KCl 0.2 g, Na₂HPO₄·12H₂O 3.48 g , KH₂PO4 0.2 g , PH为7.4）缓冲液中；然后用无菌的PBS 溶液轻轻冲洗卵巢3次，剥离残留的输卵管、脂肪组织及卵巢被膜，将剥离后的卵巢放置在装有胰酶（0.25 % 胰酶+EDTA, 37℃预热）的1.5 ml EP 管中，在37℃含有5 % 二氧化碳的培养箱中消化，为使卵巢表面充分接触胰酶，应尽量使卵巢分离开来； 30 min 后，从培养箱中取出1.5 ml EP 管，上下摇动10 次左右经，取出卵巢并将其转移到另一个装有胰酶（0.25 % 胰酶+EDTA）的1.5 ml EP 管中进行第二次消化, 在原1.5 ml EP 管中加入完全培养基终止消化，将包含有上皮细胞的液体离心（1000 r/min,5 min），弃上层液，加入1 ml 完全培养基缓慢吹打6 - 10 次，收集含小鼠卵巢表面上皮细胞的悬液，移入35 mm 培养皿，在37℃含有5 % 二氧化碳的培养箱中孵育；第二次消化的步骤与第一次相同；最后，在实验的第2 d 应尽量避免移动培养皿，利于细胞贴壁生长，同时能够维持细胞周围的微环境稳定, 在实验的第3 d 根据细胞生长情况换液, 细胞密度达80%时，使用免疫荧光法检测其上皮细胞标志物Pan-keratin的表达，阳性率达95%以上，鹅卵石样立方上皮细胞达80%以上时，进行长期传代培养；

步骤2）早期传代的小鼠卵巢表面上皮细胞：是接种代数小于15代的细胞，形态多为立方样上皮细胞，细胞核呈规则椭圆形，按2：3比例传代，时间间隔5 - 7 d，使用半量换液法，即一半新鲜DMED/F12完全培养基，一半培养皿中发黄的培养基。细胞的染色体数目多为40条；

步骤3）中期传代的小鼠卵巢表面上皮细胞：是接种代数在16至84代之间的细胞，形态为立方形与细长梭形细胞夹杂存在，出现较多多核细胞，核仁增多，按1：2比例传代；随代数增加，细胞的生长速度加快，35代后改用不加生长因子的DMED/F12培养基,60代后传代比例为1：5至1:8，时间间隔为3 - 5 d；细胞的染色体数目多为二倍体或三倍体，平板克隆形成能力明显提高，但是还没有软琼脂克隆形成能力；

步骤4）晚期传代的小鼠卵巢表面上皮细胞：是接种代数大于85的细胞，形态多呈细长梭形，按1：10比例传代，时间间隔为3 - 5 d，使用含有10%胎牛血清的高糖DMED培养基；细胞的染色体数目多为超四倍体，具有软琼脂克隆形成能力；

b．小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化鉴定

步骤1）细胞转化灶：是由密集而重叠的细胞组成。在透光检查时，用肉眼均可见有大小不等的白色斑块“转化灶”；显微镜下观察，细胞转化后胞体增大，成多边形生长无方向性，失去接触抑制，向三维空间延伸排列，细胞相互重叠；在转化灶边缘，转化细胞与正常细胞界限分明，形态区别明显；

步骤2）染色体核型分析：正常的小鼠染色体核型为40XX(XY)，使用常规染色体制片技术Giemsa染色，观察已发生恶性转化的卵巢表面上皮细胞的染色体多为超四倍体；

步骤3）软琼脂克隆形成：