[发明专利]一种抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法

权利要求书

1.一种抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法, 其特征在于包括以下步骤：

（1） 免疫原的制备：通过PCR扩增技术获得RHDV的结构蛋白VP60的N端250个氨基酸序列VP60-N，并实现其在基因工程菌中的表达，通过分离纯化获得VP60-N重组抗原；

（2）免疫产蛋鸡及提取卵黄抗体：将纯化的VP60-N抗原蛋白经佐剂乳化免疫产蛋鸡，检测抗体的纯度、特异性及滴度后，大量提取纯化IgY卵黄抗体，冷冻干燥后将抗体干粉冻存；

（3）制剂的制得：检测步骤（2）中得到的IgY卵黄抗体干粉，经无菌检验合格后，与生理盐水制备成安全的皮下或静脉注射用抗体制剂，或冷冻干燥形成干粉制剂后保存。

2. 根据权利要求1所述的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的RHDV的结构蛋白VP60的N端250个氨基酸序列VP60-N如下：

SEQ ID NO.1: GKARAAPQGE AAGTATTASV PGTTTDGMDP GVVATTSVIT AENSSASIAT AGIGGPPQQV DQQETWRTNF YYNDVFTWSV ADAPGSILYT VQHSPQNNPF TAVLSQMYAG WAGGMQFRFI VAGSGVFGGR LVRAVIPPGI EIGPGLEVRQ FPHVVIDARS LEPVTITMPD LRPNMYHPTG DPGLVPTLVL SVYNNLINPF GGSTSAIQVT VETRPSEDFE FVMIRAPSSK    TVDSISPAGL LTTPVLTGVG。

3. 根据权利要求1所述的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述PCR扩增的引物为：

上游引物 ：5’- CCGGAATTCEcoR I ATGGAGGGCAAAGCCCGCA-3’，

下游引物 ：5’- CCGCTCGAGXho I ATTGCCAACACCAGTGA-3’；

 PCR退火温度为52-55℃。

4. 根据权利要求1所述的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤（1）中免疫原的制备具体为：分析和选择兔RHDV病毒VP60的主要抗原表位决定簇肽段，即N端1-250aa肽段（VP60-N）作为免疫原；采用PCR的方法，以VP60全长基因序列为模板扩增VP60-N片段；通过基因工程技术，将该片段克隆到原核表达载体pET28a(+)上，转化基因工程菌BL21（DE3），完成VP60-N重组抗原蛋白的原核诱导表达；最后纯化重组的VP60-N抗原蛋白。

5. 根据权利要求4所述的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，其特征在于：PCR扩增后的产物，经EcoR I 和Xho I酶切回收后，与同样经过双酶切处理的pET28a(+)原核表达载体进行连接和转化，形成重组质粒pET28a-VP60-N；将重组质粒pET28a-VP60-N转化E.coli BL21(DE3)，次日挑取单菌落接种于3 ml含卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，150 rpm振荡培养；过夜培养后，按1：200接种扩大培养，待菌液OD 600值为0.6-0.8时加入终浓度为0.5 mM IPTG诱导，温度为22℃-30℃；诱导8-12 h后，12000 rpm离心收集菌体，加入终浓度为10 mg/ml的溶菌酶，冰浴1h，采用4次反复冻融法裂解菌体，12000 rpm离心15 min，收集上清，SDS-PAGE检测确定VP60-N重组蛋白以可溶形式表达后，使用Ni-NTA树脂纯化VP60-N重组蛋白抗原。

6. 根据权利要求1所述的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤（2）中免疫产蛋鸡的方法为将纯化的VP60-N重组抗原与弗氏佐剂按1:1混合乳化3-5h，之后2-3点肌肉注射免疫产蛋鸡；第一免疫后每隔一个月加强免疫一次，共加强免疫2次，第三次免疫后的第二周开始收集鸡蛋；检测蛋黄中VP60-N特异性的抗体滴度达到1:20000以上时为合格；采用水稀释法-超滤法从鸡蛋蛋黄中分离纯化出RHDV特异性的卵黄抗体IgY。