[发明专利]一种适用于阪崎肠杆菌实时荧光定量PCR检测的质粒标准分子

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一种适用于阪崎肠杆菌实时荧光定量PCR检测的质粒标准分子及其构建方法、定量方法和应用。

背景技术

阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）是乳制品中近几年新发现的引起广泛关注的一种致病菌。从1961年开始，世界范围内由该菌引起的新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎的病例相继被报道，阪崎肠杆菌被作为一种重要的食源性病原菌受到关注。多份研究报告已表明婴儿配方奶粉是当前发现致婴儿及早产儿脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎的主要感染渠道，总体死亡率高达80%，故已引起世界多国相关部门的重视。

目前阪崎肠杆菌的检测方法分为两类,一类是传统的培养及其改进方法，依赖于生化与形态学特点，检测周期较长，可操作性差;一类是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）相关方法，包括普通PCR方法以及实时荧光PCR方法，主要是针对阪崎肠杆菌区别于肠杆菌科其它细菌的多个靶基因，选择特异序列，建立PCR以及实时荧光PCR方法。阪崎肠杆菌PCR相关检测方法近年来发展迅速，由于其快速、灵敏、特异的特性，已经成为食源性病原微生物的可靠检测方法。

质粒DNA标准物质是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定量分析的标准曲线。目前质粒DNA分子作为基因检测的标准物质得到了越来越多的深入研究和应用，但是针对阪崎肠杆菌实时荧光PCR检测方法的质粒DNA标准物质还是空白。在实际阪崎肠杆菌实时荧光PCR时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的阪崎肠杆菌实时荧光PCR检测方法中缺乏阳性标准品和阳性标准品配置的问题，提供了一种适用于阪崎肠杆菌实时荧光PCR检测的质粒标准分子以及该质粒标准分子的构建方法、定量方法和应用。

实时荧光PCR检测阪崎肠杆菌的原理

采用实时荧光PCR技术可特异性扩增阪崎肠杆菌基因组DNA中16S～23S rDNA间区（ITS）序列。设计针对以上靶基因的引物和两端标记荧光的探针，扩增测试样品DNA。实时荧光PCR可以通过检测荧光信号的增加来实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质（或阳性标准分子）。在普通PCR方法中，阳性标准物质（或阳性标准分子）可以作为阳性对照；在实时荧光PCR方法中，阳性标准物质（或阳性标准分子）可以构建稳定的标准曲线，根据标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量（拷贝数或浓度）。

标准物质

标准物质是具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准设备，评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。

质粒标准分子

质粒标准分子是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定量分析的标准曲线。质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，所以可提供无限稳定量的标准物质，并且纯度较高；且操作容易，稳定性高，同一个标准分子可以同时包含多个外源目的基因，经济又高效。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种阪崎肠杆菌的质粒标准分子，该质粒标准分子包含阪崎肠杆菌的ITS序列，所述ITS序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本发明中所述的16S～23S rDNA间区（ITS）序列是指在rDNA基因中，16S rDNA和23S rDNA的基因间隔序列，它的长度和序列变化较大，将其扩增物进行RFLP或序列分析，可用于对细菌的不同生物型、菌株、种、属进行分类鉴定，甚至用于区分关系非常近的种。它也是阪崎肠杆菌检测中常用的靶基因，其序列较佳的如SEQ ID NO：1所示。

本发明的质粒标准分子，较佳地含有阪崎肠杆菌荧光PCR检测的靶基因ITS序列。本发明所述的质粒标准分子的序列较佳的如SEQ ID NO：2所示。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为：一种如上所述阪崎肠杆菌的质粒标准分子的定量方法，其包括以下步骤：

①提取质粒标准分子；