[发明专利]重组艾塞那肽的生产工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生物多肽的合成技术领域，尤其涉及一种改进的重组艾塞那肽的生产工艺。

背景技术

糖尿病是继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重危害人类健康的慢性非传染性疾病，近年来，随着人们生活方式的改变，糖尿病患病率呈急剧上升趋势。目前我国糖尿病患者已逾7000万，并且糖尿病患者增长率是欧美国家的2倍。2型糖尿病(Type 2 Diabetes，T2DM)是糖尿病的主体，占糖尿病患者的90％左右。T2DM是由遗传和多种环境因素相互作用而引起胰岛索分泌或作用缺陷。其患病率较高，尤以中老年人为多，并呈现年轻化趋势。胰岛口细胞数目减少或分泌功能障碍是导致T2DM发病的中心环节。治疗一般遵循生活方式干预(如饮食控制、运动治疗等)、口服降糖药和联合使用胰岛素等方式。传统治疗T2DM的药物的副作用都较大，长期使用会因胰岛素分泌过度导致胰岛口细胞功能衰竭。

近年来胰高血糖素样肽1（GLP1）和enendin－4成为糖尿病治疗研究的热点。因为它们具有在血糖浓度较高的情况下促进胰岛素分泌的特性，而在血糖正常的情况下不发挥作用，不仅可使初治的２型糖尿病患者血糖恢复正常，而且对磺脲类药物治疗失效者也有降血糖作用。

Exendin-4是一条39个氨基酸组成的直链多肽，最初由南美巨蜥的唾液分离提取获得。它的氨基酸残基与哺乳动物GLP-1序列有53％的同源性，并且生物学效应也几乎完全一致其与GLP-1的最大不同之处在于N端第2位的甘氨酸(Gly)耐血液中二肽基肽酶（DPP-Ⅳ），GLP-1的相同位置则为极易被DPP-Ⅳ切断的丙氨酸（Ala），故Exendin-4被吸收入血后的半衰期较长（t1/2=9.7h ）。Exendin-4是一种强效GLP-1受体激动剂，能模拟GLP-1这种内源性多肽的糖调控作用，降低空腹和餐后血糖。艾塞那肽（Exenatide）的活性主要通过与人体胰脏GLP-1受体结合而介导，由环腺苷酸（cAMP）依赖和β细胞分化机制引发葡萄糖依赖的胰岛素合成和分泌。因为Exendin-4的氨基酸结构及生物活性与GLP-1均具有相关性，故通常也被视为肠促胰岛素的一种。 由于Exendin-4的降糖作用时间较长，延缓胃排空和抑制摄食冲动对肥胖病人体重的有益作用又有别于传统的降糖药物，因此其作为2型糖尿病治疗药物开发的潜力巨大。

目前对Exendin-4进行的药物研究主要为制备工艺，作用机制，内分泌代谢病临床，分子药理学和药剂学研究。已上市的Exendin-4药物（Exenatide）采用的是多肽合成法的制备工艺。

化学合成成本高（对原料氨基酸及仪器设备要求极高）、产量少，而利用基因工程生产Exendin－4，不仅可以实现工业化的大规模生产、有效地降低生产成本，而且对环境影响小，产品品质更安全。但用基因工程方法直接表达生产Exendin-4这样的39肽，表达水平低，且容易降解，可采用与载体蛋白(如硫氧还蛋白等)连结融合表达的方法。但这种方法也存在融合蛋白分子中的目的多肽分子所占比例很小，产量很低，且融合蛋白裂解后多肽种类很多，分离纯化困难的问题。行之有效的增加基因的表达产物的方法是构建基因串联体，根据目标基因的特点和表达产物的特性，运用适当的分子生物学操作技术将目的基因按一定的方式串联在一起，置于表达载体启动子控制之下进行表达，再将表达的串联体产物用特定的物质(酶或化学试剂)裂解，以获得目标肽单体。比如pET-31b（+）是一个常用的生产多肽的质粒，但是它用来生产多肽，当初设计是为了避免多肽容易被大肠杆菌体内的蛋白水解酶水解，所以让目的多肽和KSI融合蛋白一起表达，形成了包涵体，这对生产Exendin-4来说是个很大的缺点，如果让Exendin-4先生成包涵体再复性会造成纯化成本的大大提高和活性的难以恢复，这已是重组艾塞那肽的产业化生产的瓶颈。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供重组艾塞那肽的生产工艺，旨在解决现有重组艾塞那肽的生产工艺成本高、产量低的问题。

本发明的技术方案如下：

一种重组艾塞那肽的生产工艺，包括构建工程菌的步骤、发酵表达工程菌的步骤和纯化目的蛋白的步骤；

其中，构建工程菌的步骤包括：

（1）重组Exendin－4多肽基因序列的人工合成：根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计编码Exendin－4的核苷酸序列，改造为如SEQ ID No.1所示的目的基因；