[发明专利]小鼠粘蛋白5B大鼠单抗和酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法

权利要求书

1.一种小鼠粘蛋白5B酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的试剂 盒包括连接于固相载体上的小鼠粘蛋白5B大鼠单克隆抗体，生物素化的小鼠粘蛋白5B多克 隆抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素，底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）和终止 液，所述的制备方法包括如下步骤：

（1）小鼠粘蛋白5B酶联免疫试剂盒原料的制备方法，其具体步骤为：

a、小鼠粘蛋白5B抗原的制备：

采用分子克隆技术，设计引物、酶切、转化、表达以及SDS-PAGE电泳鉴定获得小鼠粘蛋 白5B重组蛋白；

b、抗小鼠粘蛋白5B兔多克隆抗体的制备：

健康雄性新西兰大白兔1只，用小鼠粘蛋白5B重组蛋白免疫；将小鼠粘蛋白5B重组蛋白 调整至1mg/ml，取1ml蛋白，加入等体积的弗氏完全佐剂充分乳化混匀；兔后足垫、背部皮下 多点免疫，每只500μl；14d后，以小鼠粘蛋白5B重组蛋白溶液加等体积的弗氏不完全佐剂进 行加强免疫，剂量与基础免疫剂量相同；每两周免疫一次，共免疫四次，第四次免疫后14天， 从颈动脉取全血，测定抗体效价；

c、小鼠粘蛋白5B大鼠单克隆抗体的制备：

①细胞培养

小鼠SP2/0骨髓瘤细胞培养于10%新生牛血清的RPMIl640培养液中，培养条件为：5%CO₂， 37℃；

②免疫动物

选用3月雌性裸大鼠，从浓度为1mg/ml的小鼠粘蛋白5B重组蛋白溶液中取0.4ml与等体 积的完全Freund’s佐剂混合，在0、15和28d大鼠后足足底免疫，10d后用琼脂糖双向扩散法 检测，等到抗体浓度达到1mg/mL时，即完成免疫；在最后一次免疫后的3天后取腹股沟淋巴 结B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合；

③试剂

HAT选择性培养液，50×Hypoxanthine-aminopterin-thymidine(HAT)，

50×HyPoxanthine-thymidine(HT)，

PEG融合剂：5g的PEG-4000溶解于7ml的EMEM培养液中，56℃10min，120℃15min除菌，加 入lmlDMSO，经0.22μm的Millipore过滤除菌，分装成每管2ml，于37℃保存；

滋养细胞：融合前2d取大鼠腹腔巨噬细胞，浓度为2.0×10⁵cell/ml，每孔0.1ml接种于 96孔板内；

④细胞融合

取对数生长期的SP2/0细胞和免疫的大鼠淋巴结B细胞，用融合液EMEM洗两次，计数细 胞，以1个SP2/0细胞和5个大鼠淋巴结B细胞的比例混合细胞，离心1000rpm，5min，移去上 清，轻轻打松细胞团块，在37℃、90秒内加入lml的PEG融合剂，经过30秒摇动，在90秒内逐滴 加入lml的融合液，最后加入20mlEMEM培养液稀释PEG融合剂，800rpm离心5min，重悬细胞 于选择性HAT培养液中，调节细胞密度为10⁶细胞/ml，每孔0.lml接种于铺有滋养细胞的96 孔板中；

⑤筛选及抗体的制备

融合后14d，可见克隆形成，待克隆长大至相当1/3孔时，用ELISA检测有杂交瘤细胞的 培养上清，阳性孔进行两次的有限稀释法进行克隆，获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，并 将杂交瘤细胞接种于裸大鼠的腋窝皮下，3星期后长成一个2×2cm³以上的实体瘤，研磨制 成杂交瘤细胞悬液，接种于裸大鼠腹腔内，产生含有单克隆抗体的腹水；

⑥免疫亲和柱的制备

用硫酸铵沉淀法粗提单抗，用亲和层析法纯化分离得到特异性高的小鼠粘蛋白5B大鼠 单克隆抗体：将上述重组蛋白偶联到亲和层析柱上，制备成能分离小鼠粘蛋白5B大鼠单克 隆抗体的亲和层析柱，采用亲和层析法纯化大鼠腹水中的特异性抗体；

小鼠粘蛋白5B大鼠单克隆抗体的纯化具体步骤如下：将200-300ml大鼠腹水样本直接 从小鼠粘蛋白5B抗原偶联的层析柱进样口上样，流速为1ml/min；用0.1mol/LpH8.0磷酸缓 冲液30-40ml洗脱杂蛋白后，再用0.01mol/LpH8.0磷酸缓冲液20-30ml洗脱，流速为2ml/ min；最后用0.1mol/LGly-HCl洗脱缓冲液洗脱，流速为1.5ml/min，收集样本洗脱液，透析 浓缩后备用；采用间接ELISA法进行鉴定，抗体效价为1:1000000-1:2500000；

（2）ELISA试剂盒的研制：

本试剂盒应用双抗体夹心酶联免疫分析法测定小鼠血清或血浆样本中粘蛋白5B的水 平；制备过程如下：使用96孔聚苯乙烯试剂板（PS）作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照 2h，使PS板活化；在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的小鼠粘蛋白5B大鼠单克隆抗体，4 ℃过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板；检测时，向微孔中依次加 入标准品和样本，其中的小鼠粘蛋白5B与连接于固相载体上的小鼠粘蛋白5B大鼠单克隆抗 体结合，洗板之后加入生物素化的小鼠粘蛋白5B多克隆抗体，将未结合的生物素化抗体洗 净后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素，再通过亲和素化辣根过氧化物酶（HRP）放 大信号，以3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）及硫酸分别作为底物及终止液。