[发明专利]利用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，尤其涉及一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，属于猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产领域。

背景技术

目前，猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产主要是转瓶细胞培养的传统培养方式，进而增殖猪圆环病毒。但转瓶培养细胞增殖较为缓慢而且生产过程中对细胞和病毒的培养条件，如pH、溶氧、糖耗等难以监控和适时补给，无法提供最佳的培养条件，造成该方法自动化程度低，劳动强度大，并因为转瓶细胞培养环境的不可控性，导致生产的产品质量稳定性不够，批间差较大。而PCV2的生物学特殊性比较特殊，它在细胞上的增殖滴度很低，而且不引起细胞病变，因此产毒滴度较低也是一个更为重要的问题，并且与当前大规模动物疫苗生产不相适应。此外如要扩大生产规模只能通过增加转瓶数量的方法，结果导致车间规模、设备通入、人员等需求更大，劳动量更大。另外提高病毒毒价，保证良好的临床效果是解决猪圆环病毒2型灭活疫苗产业化的当务之急。而用生物反应器替代转瓶生产疫苗株则克服了上述所述不足，成为最具有前途的猪圆环病毒2型灭活疫苗生产技术之一。

WAVE波浪生物反应器是采用抛弃型生产技术进行细胞培养的一种新型反应器，其工作方式是，细胞接种于可抛弃的细胞培养袋内，接种细胞的培养袋固定在托盘上以一定的方式摇动，精密控制的摇动保证了培养体系的有效混合和传氧效率。采用WAVE波浪生物反应器培养细胞，主要优点有：1）免除生物反应器清洗、消毒及其相关认证。2）封闭培养系统，无需固定的管道，简化细胞培养厂房，缩短反应器安装和生产产品转换时间。3）细胞培养袋Cellbag放在特殊设计的摇动平台上，平台的摇动在培养液中产生波浪提供培养物混合和氧气传递，产生一个适于细胞生长的完美环境。

采用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗时，所加入微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养袋的摇动参数等生产条件对于猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力的高低等有非常显著的影响，在生产实践中需要对这些条件进行优化才能有效提高猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，该方法对微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养条件等参数进行了优化，有效提升了猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，包括：（1）细胞的培养：将PK15细胞接种到细胞培养袋中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体，洗涤培养的细胞，接种猪圆环病毒2型病毒毒种，加入病毒增殖培养基培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液灭活后，乳化，得到猪圆环病毒2型灭活疫苗；其中，所述的摇动条件为摆动角度8°、摆动速度为14rpm。

采用WAVE波浪生物反应器培养PK15细胞时，摇动培养参数对于细胞在微载体上的吸附以及细胞生长有非常显著的影响，为了筛选到最适宜的摇动培养参数以最大限度的促进细胞生长，本发明对摇动培养时的摆动角度以及摆动速度等参数进行了优化考察，观察不同的培养条件对于细胞的生长所带来的影响。通过实验发现，在对于细胞培养袋中的细胞进行摇动培养时，摆动角度以及摆动速度对于细胞的生长有非常显著的影响；本发明最终发现，当摇动培养时的培养条件为摆动角度8°、摆动速度为14rpm能够最为显著的促进细胞的生长，该培养条件下的细胞生长速度显著高于其它的培养条件。

此外，细胞接种密度与微载体含量对细胞生长的影响也密切相关，其中重要的标志是接种时要保证合适的细胞密度与载体的比例关系。在每克微载体接种相同细胞数的前提下，本发明考察微载体（Cytodex1）含量为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L时细胞生长情况，用来确定合适的载体用量。为了生产高滴度的病毒，需要细胞密度较高，同时，为了较快和高效的培养细胞，又要求细胞的细胞扩增倍数较高。从实验结果可见，随着微载体含量的增加，细胞密度会有所增加，但细胞扩增倍数较低。当微载体含量为3g/L时，不仅细胞密度高，细胞扩增倍数也较高。