[发明专利]一种新克隆载体pATC4185

说明书

  

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种克隆载体质粒。 

  

背景技术

    质粒pBR322是最早用人工方法构建成功的一种较理想的克隆载体，至今仍是基因工程中最常用和最具代表性的质粒，被广泛地用于基因工程，有“万能载体”之称。它是由博利瓦（Bolivar）等人于1977年构建而成的，是一个典型的人工质粒载体。它具有较小的相对分子质量，因而装载较大量的外源DNA；它具有较高的拷贝数，这就为重组体DNA的制备提供了极大的方便；它还具有两种抗菌素抗性基因，即氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。这为检测重组体质粒提供了方便。但pBR322质粒中的ROP（Repressor Of Primer）因子控制了pBR322质粒的拷贝数，从而降低了其质粒的复制能力，一般只能有15～20个拷贝。目前，虽然从pBR322中已经开发研制出了诸如pUC序列等许多应用广泛的质粒，但由于pBR322同时含有氨苄青霉素和四环素两种抗性筛选基因，非常便于筛选克隆，依然是许多研究者的首选克隆载体。在pBR322中，由于Rop基因的存在，质粒DNA复制受到严重影响，DNA的拷贝数低，产量低，从而影响实验研究工作效率和效果。 

  

发明内容

为了克服pBR322质粒拷贝数低的缺点，本发明提供一种克隆载体，该克隆载体不仅保留了便于筛选重组子的氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，而且去除了抑制质粒DNA复制的Rop基因，分子量较小，在同等培养条件下的大肠杆菌宿主细胞中，其质粒拷贝数和产量均比pBR322增加了3倍以上。 

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

    1、质粒pBR322经过限制性内切酶Nde I +Aor13H I 双酶切后，得到两个DNA片段，大小分别为632bp和3729bp。其中632bp的小片段是含有Rop基因的DNA片段，弃除。而3729bp大片段含有完整的Amp^R、Tet^R，以及Rep基因，回收该片段备用。

2、人工设计合成一段包含限制性内切酶Nde I +Aor13H I的寡核苷酸链，Nde I +Aor13H I 双酶切后，回收酶切片段备用。 

3、用DNA聚合酶I（Klenow fragment）在dNTP存在的条件下，将步骤1回收的3729bp DNA片段与步骤2回收的DNA片段在T₄ DNA连接酶的催化下连接，连接产物用热击转化法转化到大肠杆菌JM109中。在含有氨苄青霉素和四环素的双抗LB培养基上筛选。获得的转化子，提取质粒DNA进行酶切鉴定验证。 

    3、最终获得的新质粒pATC4185，其分子量大小为3750bp。该新质粒不含有Rop基因。 

所述的样品pATC4185于2013年7月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号  中国科学院微生物研究所，保藏编号为：7917。

本发明的有益效果是，该克隆载体不仅保留了便于筛选重组子的氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，而且去除了抑制质粒DNA复制的Rop基因，分子量较小，在同等培养条件下的大肠杆菌宿主细胞中，其质粒拷贝数和产量均比pBR322增加了3倍以上。 

  

附图说明

附图是pAT3750的限制性内切酶图谱。