[发明专利]一种ATP的检测系统

说明书

 发明领域  

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种ATP的检测系统。

发明背景

目前的准则规定，存在于重组治疗性蛋白质的核酸量小于10 pg的每日剂量的重组蛋白的DNA。因此，用于检测核酸的量极低的方法是必要的。这种方法也将得到广泛的使用，法医样品中的DNA的定量。 已经描述的核酸检测的低水平的几种方法。第一种方法是基于经典的杂交技术。此方法利用放射性标记的核酸探针结合到感兴趣的DNA。然而，这种方法有几个缺点，包括再现性差，产生大量废试剂，引起的非特异性结合的高背景水平。此外，这种技术用于确定低量的未知序列的DNA的存在通常是不适当的 检测核酸的第二种方法利用能够插入到核酸的荧光染料。然而，如清洁剂，蛋白质和脂质的许多干扰物质影响通过该方法产生的信号的再现性， 利用生物素化的检测的DNA的水平低的第三种方法的单链DNA结合蛋白（SSB），链霉抗生物素蛋白，抗稠合到脲酶DNA抗体，以及作为试剂的生物素化的硝化纤维素。此法是市售Kung等分子器件和描述，皮克总DNA定量使用SNA-结合蛋白在硅基于传感器的系统，肛交。生物化学。187：220-27（1990）。该试剂盒的操作，允许将要形成一个复杂的的链霉抗生物素蛋白，生物素，SSB，抗DNA抗体一起孵育。然后将复合体上的生物素化的过滤器捕获，洗涤，读取捕获的脲酶的量。此方法是高度敏感的，但是有几个缺点。这些缺点包括昂贵的试剂和广泛的控制的需要。 第四种方法包括解聚或降解核酸和检测由荧光素酶的ATP。多核苷酸聚合酶的核酸在细胞中的合成负责。这些酶也能够德意志和Kornberg，脱氧核糖核酸酶催化合成，生物化学杂志中所描述的催化其它反应。化学 244（11）:3019-28（1969）。很多，但不是全部，聚合酶能够解聚磷酸盐或焦磷酸盐存在下，无论是在核酸 的美国专利。第4735897号描述了一种方法，检测的多聚腺苷酸化，信使RNA（聚（A）-mRNA的）。解聚的聚（A）-mRNA的磷酸盐的存在已被证实会导致在形成ADP，它可以被转换为ATP由丙酮酸激酶或肌酸磷酸激酶。RNA也可通过核糖核酸酶消化AMP，腺苷酸激酶转化为ADP，然后转换为ATP的丙酮酸激酶 的ATP这样生产的荧光素酶检测系统检测。在ATP和O2的存在下，荧光素酶催化荧光素的氧化作用，产生光，然后可以使用光度计定量。其他反应的副产物是AMP的磷酸盐，焦磷酸盐和氧合虫荧光素， ATP的产生在所有的生物体中的酶的存在下，也允许使用荧光素酶系统的，用于检测污染细胞的存在或量的样品中，如描述在美国专利。第5648232号。例如，可能会增加ADP怀疑含有污染细胞的样品。转换的ADP转化为ATP酶的细胞的荧光素酶测定法检测，如上所述。这种方法的缺点是相对不稳定的ADP衬底， 这是本领域需要的是可靠的，成本效益的方法，核酸，细胞，细胞物质在多种类型的样品的检测非常低的水平。本发明公开了新颖的方法，用于检测的DNA，RNA和细胞数量低。这些方法利用焦磷酸或核酸酶降解的新颖的组合，转换为ATP的dNTPs，直接向ATP，AMP的转化，扩增的ATP敏感性增加，寡核苷酸探针的解聚，和优化的反应条件。 

发明内容