[发明专利]自杂交多重靶核酸探针及其使用方法

说明书

本申请是申请日为2004年7月30日的第200480028546.2号发明名称为“自杂交多重靶核酸探针及其使用方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及检测和鉴定具有感兴趣序列的核酸的探针。更具体地，本发明涉及具有多重探测区域和自身互补或自退火序列的核酸探针。

背景技术

特定核酸的检测是诊断学和分子生物学研究的重要工具。目前核酸鉴定在以下方面起着重要作用：鉴定感染性生物体如细菌和病毒；检测正常基因的表达和鉴定突变基因如癌基因；组织移植前的组织相容性分型；法医组织样品或血样配型以及考察来自不同种基因间的同源性。

决定核酸特征的“金标准（gold standard）”是感兴趣核酸的序列。虽然有几种直接测序核酸的不同方法，但是所述方法中多数仍然很麻烦，要得到核酸序列需要花费长期的时间。考虑到时间和费用，已经开发出通常应用多种核酸探针和策略的、可选的直接测序方法。然而这些方法常常不尽如人意，因为它们不能分辨亲缘关系接近的序列或因等位基因的不同组合而产生的不确定性（ambiguities）。

组织分型、亲自鉴定和疾病关联（disease association）的主要焦点集中在人类白细胞抗原（HLA）基因上。所述HLA等位基因是人类基因组中最多样的抗原系统，差不多编码数百等位基因，所述等位基因分成几个独立的亚组或亚家族。但是DNA分型的标准技术常被证明不足以分辨许多上述重要等位基因。能揭示上述基因多样性的技术如序列分析不仅很少，而且昂贵耗时。

HLA分型中的显著障碍是不确定组合，所述不确定组合源于基因重组造成的多态性起源性质。不能分辨杂合子中的顺/反序列簇的不确定性是使用如序列特异性寡核苷酸探针或测序碱基分型等技术中的主要限制。解决上述问题的方案之一是通过克隆技术分离每个具体的等位基因。但是当处理大量样品时上述方案不切实际。其他途径，如增加特异性扩增的数量，也存在缺点，因为它们仍然常常不能处理组内不确定性（intra-group ambiguities）。

因此仍然需要能检测和鉴定特异核酸，特别是亲缘关系接近的序列的方法和探针。

发明内容

本发明的一个实施方式提供了一种核酸探针，包括：

（a）对第一靶序列特异的第一探针区域；和

（b）对第二靶序列特异的第二探针区域，其中：

（i）第一探针区域和第二探针区域不连续，第一靶序列和第二靶序列不连续，或者第一探针区域和第二探针区域与第一靶序列和第二靶序列都不连续；和

（ii）所述核酸探针包括自身互补序列（self-complementary sequences）。

对核酸探针而言，第一靶序列和第二靶序列可以是在相同靶核酸或者不同靶核酸上。在上述及其它的实施方式中，所述探针能将同时包括第一靶序列和第二靶序列二者的靶核酸从不同时包括第一靶序列和第二靶序列二者的核酸区别出来。在某些实施方式中具有两个或四个自身互补序列。在另外一些实施例中，第一探针区域和第二探针区域都不包括至少部分自身互补序列。同样地，自身互补序列都不能位于第一探针区域和第二探针区域之间。

本发明的一些探针，其第一探针区域和第二探针区域的至少一个区域包括至少一个自身互补序列的部分。上述实施方式中的一些只在第一探针区域和第二探针区域的一个区域包括一个自身互补序列。一些探针第一探针区域至少包括自身互补序列之一的部分，并且第二区域至少包括另一自身互补序列的部分。在一些探针中，第一探针区域的自身互补序列与第二探针区域的自身互补序列至少部分互补。在另外的探针中，第一探针区域的自身互补序列与第二探针区域不互补；而第二探针区域的自身互补序列与第一探针区域不互补。

本发明的探针还可以任选地包括间隔区部分，该间隔区部分将第一探针区域和第二探针区域分开。所述间隔区部分可以部分或者全部由一个或多个核酸构成。核酸探针还可以任选地包括一个或多个臂序列（arm sequence），所述臂序列构成部分一个或多个自身互补序列，其中一个或多个臂序列不包括所述探针区域。在所述探针中，一个或多个臂序列的一个或多个自身互补序列，与至少部分位于探针区域之一中的自身互补序列互补。在一些探针中，所述一个或多个臂序列中的第一个臂序列的第一自身互补序列与所述一个或多个臂序列中的第二个臂序列的第二自身互补序列互补。一些探针中，一个或多个臂序列的一个或多个自身互补序列中的至少一个自身互补序列与间隔区部分的至少一部分互补。