[发明专利]一种解淀粉芽孢杆菌及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种解淀粉芽孢杆菌，同时还涉及该解淀粉芽孢杆菌在防治漂浮育苗苗期烟草灰霉病方面的用途。 

  

背景技术

由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers. :Fr) 引起的烟草灰霉病是烟草上的重要病害之一，烟草整个生育期内均可发病，以苗期及现蕾期发生较重。苗期主要发生于近地面的叶片上，病斑近圆形，褐色，具有不清晰的淡色边缘；高湿环境下病斑迅速扩展，直径可达5厘米以上，病斑呈湿腐状，其上布满灰色霉层。在集约化漂浮育苗的情况下，病菌很快扩散，严重威胁着烟苗的生产，因此对苗期烟草灰霉病的防治迫在眉睫。 

长期以来，生产上主要靠化学防治药剂来防治烟草灰霉病，主要药剂有苯并咪唑类的多菌灵、甲基托布津，二甲酰亚胺类的腐霉利(速克灵)、扑海因，氨基甲酸酯类的乙霉威及其混剂，还有苯胺嘧啶类嘧霉胺等。由于灰霉病菌具有繁殖速率高、遗传变异大和适合度高的特性, 多年连续大量使用化学药剂使得该病原菌对一些杀菌剂产生抗性, 国内外已有它对多种杀菌剂产生抗性的报道。微生物菌剂可以与病原菌竞争营养、空间位点，诱导植物产生抗病性，其次生代谢产物对病原菌具有抑制作用、对植物具有促生作用，且绿色、环保、安全，在植物病害的防治中具有重要的应用价值。因此，寻找环境友好的、高效、安全的微生物菌剂，将其用于漂浮育苗苗期烟草灰霉病的防治具有广阔的发展空间，同时也是农业安全可持续发展的需要。 

  

发明内容

本发明的目的在于克服上述问题而提供的一种对烟草灰霉病具有较好的防治效果，且有较长时间的预防作用，环境友好的解淀粉芽孢杆菌。 

本发明的另一目的在于提供该解淀粉芽孢杆菌在防治漂浮育苗苗期烟草灰霉病方面的用途。 

一种解淀粉芽孢杆菌，其形态特征：在NA培养基上培养24 小时后产生单菌落，菌落为乳白色，圆形，边缘有细齿，中间隆起，表面光滑，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢，可分泌蛋白酶、纤维素酶等。 

 该菌种已于2013年8月13日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学），保藏号：CCTCC NO: M 2013375，名称为：解淀粉芽孢杆菌X60 (Bacillus amyloliquefaciens)， 

（一）解淀粉芽孢杆菌X60 (Bacillus amyloliquefaciens)的分离步骤：

采用“稀释分离法”称取10g烟草根围土壤于洁净烧杯中，加于90ml无菌水，磁力搅拌使其充分混匀，静置20分钟后吸取0.5 ml上清液于15×150mm洁净试管中，添加4.5 ml无菌水充分混匀得10^-1浓度母液，再从稀释后的试管中吸取0.5 ml上清液，再加入4.5 ml无菌水充分混匀制得10^-2浓度溶液，依次稀释至10^-9不同浓度的土壤溶液待用。分别吸取上述不同浓度土壤溶液100μl，均匀涂布于培养细菌的NA平板上，28℃黑暗培养，待细菌长出后挑取单菌落纯化。

（二）培养基： 

牛肉膏蛋白胨固体培养基（NA）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂粉16g，水1000ml，pH 6.8～7.2。

牛肉膏蛋白胨液体培养基（NB）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，水1000ml，pH 6.8～7.2。 

（三）菌种的保种和传代： 

用18×180mm的试管，盛NA培养基9ml，做成斜面，接种细菌，28℃培养2-3天，置4℃保存，3个月转种一次。

将纯化后的细菌在NA培养基上划线培养，待细菌长出后挑出单菌落，用灭菌的牙签将细菌单菌落挑至装有5ml NB培养基的试管（15×150mm）里摇培24h，吸取700μl菌液至2ml菌株保存管中，再向保存管中添加700μl 30%灭菌甘油，置于-20℃冰柜中长期保存。 

（四）菌种的性态特征： 

该菌形成的菌落在NA平板上，30℃，培养2d，菌落直径5～15mm，菌落近圆形、白色、半透明、光滑湿润、稍隆起，菌体为短直杆状，为好氧细菌，革兰氏反应阳性。经细菌鉴定手册描述，结合Biolog鉴定结果及16S rDNA序列分析结果，将这一菌株记为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens X60)。

（五）菌种的培养特性