[发明专利]一种高效获取蛹虫草有效接种体的菌种分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛹虫草栽培技术领域，具体涉及一种蛹虫草菌种及遗传特性保持的方法。

背景技术

蛹虫草(Cordyceps militaris(L.Fr)Link)，又名蚕虫草、北冬虫夏草，属子囊菌门(Ascomycota)、核菌纲(Pyrenomycetes)、球壳目(Sphaeriales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草属(Cordyceps(Fr.)Link)真菌。蛹虫草是虫草属真菌的模式种，在自然界多寄生多种鳞翅日昆虫的幼虫和蛹上。

近年来，研究表明，人工栽培的蛹虫草化学成分及药理作用与冬虫夏草相似，但价格却远远低于冬虫夏草，因此，蛹虫草的开发应用具有极大的潜在市场。

人工培养蛹虫草是解决野生虫草来源不足的良好途径，相关的研究很多，然而人工培养过程中菌种退化现象严重是制约产业化开发的一大瓶颈。影响人工培养蛹虫草菌种退化的因素很多，简单的可以分成两的大类，一类是菌株的遗传特性造成菌种的退化(内因)。一类是培养条件、操作环节、环境因素导致的菌种退化(外因)。

在实际的蛹虫草规模化生产的菌种分离和筛选过程中，最常采用的是组织分离法。组织分离法就是指通过子实体组织分离获得纯菌丝的方法。食用菌的子实体实际上就是菌丝体的纽结物，它具有很强的再生能力。因此，只要切取一小块子实体组织，把它移植到培养基上，就能获取纯粹的菌丝体。

组织分离培养，从生物学的角度来看，乃是一种无性繁殖，是从组织—菌丝—组织—菌丝周而复始的循环过程，遗传变异小，但在无性繁殖过程中可能产生自然变异和突变，但组织分离产生的变异不很大，是一种累积、渐进的过程，变异是绝对的，稳定是相对的。组织分离法还会因取样时子实体发育的不同时期和部位，以及个人的经验和技巧而产生不同的结果。

组织分离法取样位置不同遗传特性产生区别的一个典型事例是：香菇同一菌种子实体菇肉、菇柄组织分离物与菌丝体间既保持了遗传物质相对稳定性和遗传性状的稳定性(DNA相似性在88%以上)，存在着相对的遗传变异，虽然变异极为细微，但是预示着一种潜在必然趋势，反映了累积、渐进的漫长过程，这是由于内、外因造成的，但主要是由于遗传型的变异造成的，育种工作者不应忽略这种变异的存在，因为这很可能是造成某些菌种退化和变异的原因所在（香菇子实体组织分离物与菌丝体的遗传相关性，上海农业学报，1997，13(4)：85～88）。

1999年上海农科院“北冬虫夏草子实体人工高产栽培技术及其工厂化生产研究”，首次向国内外真菌学界提供了“Cordyceps militaris”菌株有性结构的细胞学证据。证明了子实体外层内的双核细胞为有效接种体，子实体的薄壁细胞为无效接种体。

常规的蛹虫草组织分离方法取得分离组织块后，往往是子实体外层的表面的薄壁组织细胞和疏松组织细胞先增殖，随后是子实体外层内的双核细胞增殖。因此造成了常规组织分离法获得的蛹虫草平板菌落可育菌丝部分和不可育菌丝很难区分，界限不明显，最终表现为蛹虫草菌种的不稳定。

发明内容

本发明的目的就是利用热激法使外层组织细胞蛋白变性，阻止不可育部分组织细胞的增殖，只让能形成有效接种体部分的组织细胞增殖，从而使蛹虫草平板菌落可育菌丝部分和不可育菌丝明显可以区分，使蛹虫草菌种稳定遗传。

为实现上述目的，本发明具体地包括如下内容：

1、子实体亲本的选择：

选取正在栽培瓶中生长中后期的没有受到污染的，子实体生长迅速、条形整齐，粗细均匀、颜色橘红、子囊果尚未发育的栽培瓶经过瓶表面消毒后放入超净工作台。在无菌条件下，用镊子夹取头顶部2-3cm，放入干热灭菌后的培养皿内，待处理。

2、子实体亲本的处理：

方法一：用镊子夹住用来组织分离的子实体，在65-85℃的无菌水（此无菌水事先在121℃，20min高温高压灭过菌）中停留0.5-2.0秒（温度越高时间越短，表层细胞受损而保护内层细胞），然后迅速转入到冰箱冷藏室冷藏的4℃的无菌水（此无菌水事先在121℃，20min高温高压灭过菌）中停留2-5分钟，然后取出放置于干热灭菌的内置吸水滤纸的培养皿内，待用。

方法二：用镊子夹住用来组织分离的子实体，在75%酒精中停留30-120秒，然后迅速转入到无菌水中洗涤三遍，然后取出放置于干热灭菌的内置吸水滤纸的培养皿内，待用。