[发明专利]一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置

权利要求书

1.一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，适用于具有脉冲激发光和连续损耗光的STED超分辨显微系统，其特征在于，包括以下几个步骤：

1）同时启用脉冲激发光和连续损耗光，所述的脉冲激发光和连续损耗光转换为圆偏光后经显微物镜聚焦到荧光样品表面，收集荧光颗粒发出的荧光，得到聚焦点的荧光强度和荧光寿命；

2）横向移动所述的荧光样品，重复步骤1），获得对应扫描区域内各扫描点的荧光强度信息和荧光寿命信息；

3）对步骤2）获得的荧光强度信息和荧光寿命信息进行分析，选择单颗荧光颗粒的荧光强度光斑、拟合光斑中心并记录光斑中心坐标，同时提取所述荧光强度光斑对应的寿命分布，拟合寿命的最长点并记录最长点坐标，计算得到光斑中心与寿命最长点的距离；

4）根据步骤3）算得的距离，改变所述连续损耗光入射显微物镜的角度，使光斑中心与寿命最长点完全重合，完成光斑的横向对准；

5）对步骤3）中选择的单颗荧光颗粒，重复步骤1）中的操作，选取穿过颗粒中心的轴向切面进行扫描，并移动所述的荧光样品完成轴向二维扫描，获得对应各点的荧光强度信息和荧光寿命信息；

6）根据步骤5）中单颗荧光颗粒的椭圆荧光光斑及荧光光斑对应的寿命分布，调节所述连续损耗光的发散度，使得长寿命区域贯穿荧光光斑的中间区域且沿椭圆荧光光斑长轴和短轴呈轴对称分布，完成光斑的轴向对准。

2.如权利要求1所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，其特征在于，以荧光样品的颗粒稀疏区域作为所述步骤2）中的扫描区域。

3.如权利要求2所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，其特征在于，所述颗粒稀疏区域确定方法为：

单独使用脉冲激发光，并将脉冲激发光调制为圆偏光，然后由显微物镜聚焦到样品表面，对样品表面进行二维扫描，收集荧光颗粒发出的荧光，得到相应的扫描图像，根据所述扫描图像上荧光颗粒的分布，选取所述的颗粒稀疏区域。

4.如权利要求1所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，其特征在于，所述的脉冲激发光和连续损耗光转换为经相位调制后的平行光。

5.一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，其特征在于，包括：

沿脉冲激发光光路依次布置的脉冲激发光生成装置和脉冲激发光快门；

沿连续损耗光光路依次布置的连续损耗光生成装置、连续损耗光快门和二色镜；

四分之一波片，用于将所述的脉冲激发光和连续损耗光调制为圆偏光；

显微物镜，用于将所述圆偏光聚焦至荧光样品并收集荧光；

信息采集装置，用于采集所述显微物镜收集荧光的强度信息和寿命信息；

以及与所述信息采集装置连接的计算机。

6.如权利要求5所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，其特征在于，所述的脉冲激发光生成装置包括沿光路依次布置的脉冲激光器、第一单模保偏光纤、第一准直透镜、第一起偏器、第一四分之一波片和第一二分之一波片。

7.如权利要求5所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，其特征在于，所述的连续损耗光生成装置包括沿光路依次布置的连续激光器、第二单模保偏光纤、第二准直透镜、第二起偏器、第二四分之一波片、第二二分之一波片和0～2π涡旋位相板。

8.如权利要求5所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，其特征在于，所述的信息采集装置包括沿收集荧光的光路依次布置的滤光片、透镜、多模光纤、雪崩二极管和时间相关单光子计数系统，且时间相关单光子计数系统分别与所述的计算机和脉冲激发光生成装置连接。