[发明专利]一种Δ12-脂肪酸脱氢酶基因及其重组表达载体

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域和遗传工程领域，涉及一种Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因及其重组表达载体，具体涉及从酵母---圆红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中克隆的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因及将该基因直接与不同载体连接，转入细菌、酵母、植物或动物中，利用其编码Δ¹²-脂肪酸脱氢酶产生不饱和脂肪酸。

背景技术

Δ¹²-脂肪酸脱氢酶(Δ¹²-fatty acid desaturases)又称油酸脱氢酶(oleate desaturases)。Δ¹²-脂肪酸脱氢酶属于一类膜整合酶，由于分离和鉴定膜结合蛋白的难度很大[MaKeon，1981，酶学方法，12141-12147；wang等，1988，植物生理学生物化学，26:777-792]，因此很难得到包括Δ¹²-脂肪酸脱氢酶在内的各种膜结合蛋白性质脱氢酶高级机构，而只能通过对酶的核苷酸序列进行初步研究，或者在异源的受体内表达来研究酶的底物特异性。序列对比的结果表明，编码Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列具有共同的机构特性：存在三个组氨酸保守区，形成四次跨膜的结构[Kyte et al，1982，J.Mol.Biol.157:105-132]，这些都是维持脱氢酶所必须的。

Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的主要作用是在单不饱和脂肪酸油酸(oleic acid)的第12和13位碳原子之间插入一个双键，形成含有2个双键的多不饱和脂肪酸-亚油酸(linoleic acid)。Δ¹²-脂肪酸脱氢酶是油酸脱氢形成亚油酸的关键酶，是多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid)代谢ω-3、ω-6途径的限速酶，控制着植物细胞中大多数不饱和脂肪的合成，只存在于植物和微生物中，人和哺乳动物细胞中缺乏在脂肪酸的第9位碳原子以上位置引入不饱和双键的脱氢酶，这些多不饱和脂肪酸必须从食物中获取。因此，亚油酸和α-亚油酸是人体必须脂肪酸，膳食性摄入亚油酸和α-亚油酸，经Δ6-脂肪酸脱氢酶催化转化成γ-亚油酸和十八碳四烯酸，它们又在其它相关酶的催化下可进一步转化成其它长链多不饱和脂肪酸[Horrobin DF，1992，Prog Lipid Res，31:163-194]。这些长链多不饱和脂肪酸是有机体组织生物膜组成成分，起到维持细胞正常功能和增加机体抗逆性的作用[Napier JA et al，1999，Curr.Opin.Plant Biol，2:123-127]，因此包括亚油酸在内的多不饱和脂肪酸在保健和医疗方面有很广阔的应用前景。研究不饱和脂肪酸的合成和它的生理作用成为当前的热点。

对于脂肪酸脱氢酶的生物学功能，许多实验室采用了从各种生物体中克隆相关的基因并转入各种受体中，在受体中观察受体的脂肪酸改变的方法。目前，已从动物、植物、微生物等不同来源中分离到许多Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因的同源序列，并且证明具有相应的生物学功能。尤其是近几年来随着双功能Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的发现[Edgra B. Cahoon et al，2001，THE JOURNAL OF BIOLIGICAL CHEMISTRY，26：2637-2643.]和共轭油酸在医疗保健功能的发掘，人们越来越认识到不饱和脂肪酸的重要性，并且常规的生物化学方法很难分离纯化膜结合的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶，研究其在自然环境中的生化特性比较困难，因此人们的注意力又开始转向对Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的研究上。

目前，不饱和脂肪酸主要来源于动物、植物和低等生物等，与动植、物油生产PUFAs相比，微生物油脂的生产有很多优点，如生产周期短、微生物方法生产不受场地、气候、季节的影响及利用不同的菌种和培养基适合开发功能油脂等。目前分离到的脱氢酶和延伸酶效率较低且大多数对脂肪酸底物链长、双键数目及双键位置不具有严格的专一性，除目标产物外，还会生产一些非特异脂肪酸。由于这些脂肪酸的作用还不清楚，所以它们的出现不利于转基因植物的商业化应用，因此需要继续筛选具有高的底物特异性的脱氢酶和延伸酶。应用基因工程技术构建特异性生产多不饱和脂肪酸的转基因油料植物，直接改善油脂品质，更加具有实际应用价值。本研究通过多种手段发掘多不饱和脂肪酸合成的高效、特异性新基因，为新一代转基因脂肪酸产品的品质改良奠定基础。

发明内容