[发明专利]表达分泌金葡菌肠毒素蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用基因工程技术构建获得的能够表达分泌金葡菌肠毒素蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗以及其构建方法和应用。 

背景技术

癌症是威胁人类健康和生命的杀手，每年因患恶性肿瘤致死的病例已经上升到各种疾病的首位。目前肿瘤的主要治疗手段是手术、放疗和化疗。尽管医学家们不断完善这3大治疗手段，但许多癌症患者仍然难以得到治愈。由于肿瘤本身易转移和复发，使传统的手术、放疗和化疗效果有限。目前，肿瘤免疫治疗已成为一种比较有效的治疗方法。肿瘤的免疫治疗包括抗体、细胞因子、疫苗和细胞治疗。它是一种新型的主动性免疫疗法。随着肿瘤免疫学和分子生物学的发展,肿瘤与机体之间的相互作用、肿瘤免疫耐受以及肿瘤抗原鉴定都取得了很大的进展,这也促进了肿瘤疫苗的发展。目前,很多抗肿瘤疫苗在动物水平和临床试验已取得令人鼓舞的效果。作为一种高效、无明显毒副作用的肿瘤免疫疗法已经成为了人类预防和治疗肿瘤疾病的必然趋势。 

金黄色葡萄球菌肠毒素是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，以下简称金葡菌)分泌产生的外毒素，肠毒素是金葡菌在宿主体内导致疾病的主要原因。目前，已有超过17种金葡菌肠毒素获得鉴定，包括典型的肠毒素(SEA、SEB、SECs、SED和SEE)以及新发现的多种肠毒素蛋白（Letertre C,et al.J.Appl.Microbiol.2003,95(1):38-43.）。 

超抗原(Superantigen，SAg)是指一类只需极低浓度(1-10ng/ml)就可以激活大量的T细胞活化，产生极强的免疫应答的抗原因子。超抗原的作用途径不需要呈递细胞的加工处理，而是以完整的蛋白质形式呈递给T细胞，其一端与APC膜上的MHCⅡ类分子的非多态区外侧结合形成超抗原MHC复合物，另一端直接与TCR的vβ片段外侧结合，诱导免疫应答反应。 

金葡菌肠毒素蛋白分子作为典型的超抗原物质，对宿主免疫系统具有强烈 的免疫刺激作用。因此，肠毒素很早就开始作为新的抗肿瘤蛋白分子进行研究。肠毒素蛋白分子对肿瘤细胞的杀伤分子机制包括：(1)SAg依赖性细胞毒(SDCC)作用和SAg抗体依赖性细胞毒(SADCC)作用。由于SAg不需要抗原呈递细胞（APC）的处理，能以完整的蛋白质分子形式，一端在抗原结合沟外与APC上的MHC类分子连接，另一端仅与T细胞受体(T cell receptor，TCR)的vβ片段连接，不需APC处理，也不受MHC的限制，在APC外形成MHC类分子-SAg-TCR-vβ复合物，在极低的摩尔浓度(10^-12数量级)下便可刺激存在TCRvβ序列的T淋巴细胞大量增殖，能够在短时间内直接激活具有很强杀伤力的CD8+细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)和与CD4+相关的辅助性T细胞产生，以TCR-vβ-SAg-MHC-II类分子的方式以及MHC-II类分子相关的肿瘤细胞相偶联后产生强力的杀灭作用，对表达具有MHC-II类分子有关的肿瘤细胞进行直接杀灭（Kuge S,et al.J Immunol.1995,154(4):1777-1785.）。(2)细胞因子的直接和间接杀伤作用。超抗原活化的于CD4+相关的T淋巴细胞能分泌包括TNF-α、TNF-β、INF-γ、IL-2、IL-6和IL-12等多种足量的细胞因子。它们不仅能通过直接作用或间接作用的方式杀伤肿瘤细胞，而且可以促使肿瘤细胞增加表达MHC类抗原分子，进一步增强对宿主免疫系统的刺激作用（Matsushita K,et al.Br J Cancer.1996,73(5):644-648.）。(3)超抗原刺激T细胞后，T细胞释放的IL-2、INF-γ和IL-12等细胞因子，可产生广谱抗肿瘤的淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)，进一步产生LAK样细胞毒作用（Lando P,et al.Cancer Immunol Immunother.1991,33(4):231-237.）。 

BCG（Bacillus Calmette-Guérin）作为预防结核病的疫苗已经得到广泛的使用。BCG作为重组疫苗载体具有其他疫苗载体不可比拟的优越性。BCG在全世界范围内应用最广泛，它是一种耐热活疫苗，生产成本低，且应用于实验动物和人体并发症少。因此，把BCG作为活菌疫苗载体，是目前构建重组疫苗的理想选择。