[发明专利]体外筛选体内抗菌活性噬菌体的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体而言，涉及一种体外筛选抗菌活性不受某生物体体内补体影响的噬菌体制剂的方法。 

背景技术

人们对细菌感染性疾病的治疗常采用的方法是使用各种抗生素。但随着大量广谱抗菌药物的长期应用，尤其是滥用，细菌耐药问题逐年加剧，一系列耐药病原菌，如结核杆菌、金萄菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、肠球菌和铜绿假单胞菌等，引起公众的广泛关注。尤其是近10年来，肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌以及铜绿假单胞菌对所有常规使用的抗生素全耐药菌株(Pan-resistant strains)的出现，让人们意识到：抗生素治疗革兰氏阴性菌感染的时代已接近终点。更为严峻地是，目前处于临床试验阶段的新抗菌药物不足30种，而其中大多数仍是对传统药物的结构修饰物。另外，对15个全球最大的跨国制药公司研发部门的调查表明：目前只有不到10种的抗生素制剂处于研发阶段，未来可用于临床的新抗生素的研发前景不容乐观。研发新型抗生素的速度是远远落后于细菌对抗生素产生抗性的速度，“后抗生素时代”即将来临，因此，寻找抗生素以外的新型抗菌制剂已势在必行。在这样的时代背景下，噬菌体治疗重新受到人们的关注，自2000年以来，国外已发表了多篇关于噬菌体治疗的综述，多株临床耐药菌的噬菌体相继被分离并得到深入研究。 

噬菌体治疗(phage therapy)就是运用噬菌体及其产物来预防和治疗各种细菌感染性疾病的方法。噬菌体(bacteriophage/phage)是能够感染细菌的病毒。据估计：在生态环境中，每48h就会有约一半数量的细菌要被噬菌体感染。噬菌体通过限制细菌的数量、种类、以及改变细菌的代谢能力和生活史等途径对微生物的生物化学循环以及进化起着重要影响。噬菌体最早是由Twort和Herelle D两人分别于1915年和1917年发现。当时，虽然对噬菌体生物学特性的认识还很浅，但就已经用它来治疗疾病了。首次噬菌体治疗的公开报道是在1921年，Richard B.和Joseph M.用噬菌体治疗葡萄球菌引起的皮肤感染。在注射给药后的48小时之内，感染消退。H.W.Smith和M.B.Huggins用噬菌体制剂治疗小鼠的大肠杆菌全身感染，小鼠在接种10⁶CFU/ml的病原菌后致死率为100％，但当提前接种大肠杆菌噬菌体10⁴PFU/ml后，无一例发生死亡。这种噬菌体制剂的疗效比用四环素、链霉素、氯霉素、氨苄青霉素、三甲氧苄二氨嘧啶等抗生素的效果要好。这些满意的疗效激起了人们对噬菌体治疗研究的热情，自1917年到1956年期间共发表800余篇有关噬菌体治疗的报道，所治疗的疾病有痢疾、伤寒、副伤寒、霍乱、化脓及尿道感染等，给药方式分为皮内、皮下、静脉、腹膜内、肌肉注射等，还有直接用于肺、颈动脉及心包的。当时许多研究机构和生物公司也对噬菌体的临床应用产生了兴趣，开始将噬菌体用于临床治疗。虽然当时许多噬菌体治疗的尝试都是成功的，但绝大部分实验结果都刊登在乌克兰和乔治亚的期刊中，并没有传到西方，即使有一小部分传到西方科学界，也因实验设计不够周密、实验数据不够详细以及缺乏相应的对照实验而受到西方学者的摒弃。另外，从商业角度上说，对噬菌体治疗的知识产权很难划定，这些都是当时西方世界未对噬菌体治疗进行深入研究的原因，加上后来抗生素的成功推广，及其所表现出的快捷、高效、简便的优势，许多国家停止了对噬菌体治疗的科学研究。 直到20世纪末，快速加剧的细菌耐药现象促使人们重新审视噬菌体作为抗菌制剂所具有的巨大潜力，越来越多的研究人员意识到利用噬菌体来预防和治疗细菌感染的可行性和广阔前景。 

噬菌体制剂以其杀菌特异性强、自然资源丰富、易于工程改造等抗生素无法比拟的优点，必将成为未来治疗全耐药菌株(对所有常规使用的抗菌药物全耐药的细菌，即所谓的“超级细菌”)所造成感染的新型抗菌制剂。然而，噬菌体在防治疾病的过程中也存在很多需要克服的问题，此处不再详述，仅将本发明所涉及的一项要解决问题叙述如下： 

噬菌体无论数量还是种类都是自然界最为丰富的物种之一，从环境中分离到可以杀灭各种多重耐药菌的噬菌体并非难事，但并不是所有新分离到的噬菌体在生物体内都能行驶其抗菌活性。因为生物体内存在很多可以影响噬菌体杀菌的因素，因此噬菌体抗菌活性在体内和体外会存在很大差异。传统的筛选体内具有抗菌活性噬菌体的方法主要是通过动物实验，对这些新分离到的噬菌体未经过一个初筛而直接进行动物实验，势必造成实验动物的浪费、研究成本的提高和研究周期的增长。