[发明专利]定量检测食品及中药中亚胺硫磷含量的试剂盒及应用方法

权利要求书

1.定量检测食品及中药中亚胺硫磷含量的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒由试剂组和包被板组成，所述的试剂组包括： 

（1）浓缩PBS缓冲液：40mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，使用时用双蒸水5倍稀释； 

（2）底物A：含过氧化氢脲的乙酸钠缓冲溶液； 

（3）底物B：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液； 

（4）浓缩洗涤液：含1%吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，使用时用双蒸水5倍稀释； 

（5)终止液：1.25M的硫酸； 

（6）亚胺硫磷标准溶液：其亚胺硫磷标准溶液母液为1mg/mL，使用时用PBS缓冲溶液稀释到100μg/mL后，再按1:4稀释6个梯度； 

（7）酶标记的亚胺硫磷抗原溶液：亚胺硫磷半抗原与辣根过氧化物酶的偶联物，使用时用PBS缓冲液稀释10万倍； 

所述酶标记亚胺硫磷抗原是按下述方法制备的： 

①N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸的合成： 

称取131mg的氨基己酸，106mg的无水Na2CO3于3mL蒸馏水中，加入225mg N-邻苯二甲酰亚胺基甲酯，室温搅拌至完全溶解，约1小时反应终止；过滤，滤液酸沉至沉淀完全，乙酸乙酯提取，无水Na2SO4干燥，得到亚胺硫磷半抗原； 

②亚胺硫磷活化酯的合成： 

称取463mg亚胺硫磷半抗原，254mg N-羟基琥珀酰亚胺溶于无水四氢呋喃中，N2保护下，滴加溶有454mgDCC的无水四氢呋喃溶液，搅拌过夜，过滤除去白色沉淀，旋除有机溶剂，经硅胶柱纯化得到白色固体的亚胺硫磷活化酯； 

③酶标记亚胺硫磷抗原合成 

精确称取0.001g亚胺硫磷活化酯，活化酯溶解于200μL N,N－二甲基甲酰胺中，10mg  HRP溶于2mL pH值为9.3的K2HPO4溶液中，冰浴下，亚胺硫磷活化酯13倍过量缓慢逐滴加入酶溶液中，边滴边摇匀，4℃旋转放置过夜，将反应液装入透析袋，于4℃条件下PBS透析三天，透析液冷冻干燥得到白色粉末，贮于-20℃下备用； 

所述的包被板为96孔或48孔酶标板，是由多克隆亚胺硫磷抗体包被于酶标板上，多克隆亚胺硫磷抗体用pH为9.6的Na₂CO₃——NaHCO₃包被缓冲溶液稀释到1μg/100μL，然后以每孔100μL包被于酶标板中，4℃过夜或者37℃恒温温育3小时，弃去包被溶液后用洗涤液洗板三次，加入200μL冻干液封闭1小时，洗涤液洗板四次冻干后真空包装，于4℃保存。 

2.根据权利要求1所述的定量检测食品及中药中亚胺硫磷含量的试剂盒，其特征在于所述的多克隆亚胺硫磷抗体经5次免疫制备，制备方法是： 

免疫：免疫动物采用雄性新西兰大耳白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，共进行5次免疫，加强免疫分别在初次免疫后第2周，第4周和第6周进行三次，隔一个月进行第五次，从第3次免疫后开始采血测效价，采血时间为免疫后第10天； 

初次免疫：取1mg人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式完全佐剂等体积配制的溶液中，进行动物免疫； 

加强免疫：取0.5mg人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式不完全佐剂等体积配制的溶液中，进行动物免疫； 

抗体纯化：定时检测动物抗体效价，当抗体对包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用Sepharose4B-Protein A亲和层析柱对抗血清进行纯化，制备抗体； 

所述人工抗原用半抗原N-邻苯二甲酰亚胺基甲酯与6-氨基己酸，以酰胺基CONH为桥梁，通过活性酯法，分别连接到卵清蛋白或血蓝蛋白上，合成人工抗原；具体做法是： 

取上述亚胺硫磷活化酯溶于DMF配成溶液A，KLH或OVA溶于磷酸缓冲溶液中配成溶液B，活化酯和蛋白的摩尔比13：1～40：1然后在冰浴下将溶液A缓慢的加入溶液B中，经搅拌后在4℃下反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，在4℃，pH=7.4的PBS溶液中透析三天，精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度和结合比，分装，-20℃下贮藏。 

3.根据权利要求1所述的定量检测食品及中药中亚胺硫磷含量的试剂盒，其特征在于：冻干液为含BSA的Tris-HCl缓冲溶液。