[发明专利]用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组应用及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及禽流感病毒的检测，尤其涉及用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组、该引物组的应用以及检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP试剂盒。

背景技术

流感病毒（Influenza virus）属于正粘病毒科流感病毒属，根据NP 蛋白和M 蛋白的不同可将其分为甲、乙和丙三型。流感病毒基因组是由8 条负链RNA 节段组成，编码11 或12 个蛋白，其中两个糖蛋白血凝素蛋白HA 和神经氨酸酶蛋白NA 较为重要，二者位于病毒粒子表面。病毒RNA 与核糖核蛋白及三个RNA 依赖的RNA 聚合酶亚基PB2、PB1 和PA 相连。已知甲型流感病毒已在多种动物体内分离到，包括人、猪、马、鲸、海豹和鸟类等。根据其血清学检测，现已经鉴定出17 个HA 亚型（H1-17）和9 个NA 亚型（N1-9）。

根据毒力大小的不同，流感病毒可分为低致病性禽流感（LPAI）和高致病性禽流感（HPAI），已知的17个HA 和9 个NA 亚型均能在水禽中分离到，其中仅H5 和H7 亚型的部分毒株属于HPAI，其余均属于LPAI。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感。禽流感病毒中，H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性。2005 年，中国西部青海湖地区发生了水禽感染HPAI 的H5N1，导致野鸟大面积死亡，所以要注意到迁徙鸟中的HPAI  H5N1 流感病毒的潜在危险。随后，在东南亚不同地区都出现了基因型和抗原性不同的新型HPAI  H5N1，并在家禽中广泛流行。同时亦不能忽视家禽转运和鸟类迁徙过程在HPAI H5N1 的远距离传播中的作用，这也解释了欧洲、中东和非洲地区等地区频繁暴发禽流感的可能原因。

流感病毒的HA 蛋白对受体的特异性和亲和力是决定宿主嗜性和传播能力的关键因素之一。1918 年H1N1 流感病毒会受HA 蛋白上190 和225 位氨基酸的影响；D225G 突变体下降了α2,6 唾液酸结合的亲和力，导致与人气管中杯状细胞的结合力下降，从而使病毒在雪貂中的传播能力下降。同时H5N1 病毒在识别不同的受体结合特性是由不同的氨基酸残基引起的。同样，在受体结合位点附近的残基差异使其它禽或流行的流感病毒的受体结合特性变得更加复杂，表明在不同的HA 亚型中受体的特异性是不同的。

我国一直被认为是禽流感的高发和易发地，经常是多种亚型AIV并存的情形。LPAIV 不像HPAIV 可引起野鸟和家禽的大面积死亡，但仍然存在较多的潜在危险，如重组变异形成新的病毒等。因此LPAIV 仍然需要相当的重视。

H4 亚型AIV 属于LPAIV，国内分离到的毒株较少，因此对之研究较少。国际上目前有韩国、俄罗斯等国家均报道分离到该亚型。哺乳动物分离到的该病毒是1999 年在加拿大猪体内分离到一株H4N6 病毒，序列分析表明，其各病毒节段均为禽源，但HA 基因的226L的特征使该病毒具有了感染猪的能力，由此暗示H4亚型病毒可能在哺乳动物体内逐渐适应。

目前，H4流感病毒检测主要依赖病毒分离和分子生物学检测，但是不能进行敏感特异快速的检测方法。所以目前为止还没有确定一种最具有临床使用价值的基层分子生物学诊断方法。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组，还提供了上述的用于检测H4亚型禽流感病毒RT-LAMP的试剂盒。

用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组，该RT-LAMP引物组其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2 、SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4所示。

上述的RT- LAMP引物组在制备检测或诊断H4亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途、在制备检测或诊断鸭坦布苏病毒的生物试剂中的应用也是本发明所要保护的范围。

用于检测H4亚型禽流感病毒RT-LAMP的试剂盒，包括反应混合液、酶混液和蒸馏水，该试剂盒还包括荧光检测试剂及权利要求1所述的引物组。

H4亚型禽流感病毒RT-LAMP检测的试剂盒在制备检测或诊断H4亚型禽流感病毒的生物试剂中的应用、制备检测或诊断鸭坦布苏病毒的生物试剂中的应用也是本发明所要保护的范围。