[发明专利]在样品中检测靶核酸的方法

权利要求书

1.一种扩增、检测和定量靶核酸的方法，其包括以下步骤：

(a)将样品在聚合酶的存在下与一对引物接触，所述引物与靶核酸的序列可特异性杂交，其中所述聚合酶为具有3’-5’外切活性的聚合酶，并且所述一对引物中的至少一个为报告引物，其特征在于：所述报告引物的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，所述报告基团的信号被淬灭基团淬灭，并且所述报告引物的3’端的两个或两个以上核苷酸与靶核酸的序列错配，所述报告基团标记在错配的核苷酸上；

(b)实施一个或多个循环扩增步骤，所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤，所述杂交步骤包括使由所述引物与靶核酸特异性杂交，所述核酸延长步骤包括在所述聚合酶的催化下,引物延伸和生成自所述靶核酸衍生的扩增产物；

(c)测量报告基因的信号，由此对靶核酸进行检测和定量。

2.权利要求1的方法，其中所述具有3’-5’外切活性的聚合酶的保真性为错误率小于约1%，更优选为小于0.1%。

3.权利要求1的方法，其中所述具有3’-5’外切活性的聚合酶选自pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶和Vent DNA聚合酶，优选为KOD DNA聚合酶。

4.权利要求1或2的方法，其中所述报告引物的3’端的两个核苷酸与靶核酸的序列错配。

5.权利要求1或2的方法，其中所述报告引物的3’端的错配的两个核苷酸上标记一个所述报告基团。

6.权利要求1或2的方法，其中所述一对引物中的一个为报告引物。

7.权利要求1或2的方法，其中所述一对引物中的两个为报告引物。

8.权利要求1或2的方法，其中所述报告引物具有15-50个碱基，优选为18-35个碱基。

9.权利要求1或2的方法，其中所述报告基团为荧光报告基团。

10.权利要求9的方法，其中所述报告基团选自荧光素染料（例如FAM、JOE和HEX），罗丹明染料（例如R6G、TAMRA、ROX），和花青染料（例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7）。

11.权利要求1或2的方法，其中所述淬灭基团选自荧光素染料（例如FAM、JOE和HEX），罗丹明染料（例如R6G、TAMRA、ROX），和花青染料（例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7）。

12.一种用于扩增、检测和定量靶核酸的试剂盒，其中包括聚合酶和一对引物，所述引物与靶核酸的序列可特异性杂交，其中所述聚合酶为具有3’-5’外切活性的聚合酶，并且所述一对引物中的至少一个为报告引物，其特征在于：所述报告引物的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，所述报告基团的信号被淬灭基团淬灭，并且所述报告引物的3’端的两个或两个以上核苷酸与靶核酸的序列错配，所述报告基团标记在错配的核苷酸上。

13.一种用于扩增、检测和定量靶核酸的反应混合物，其中包括待测样品，聚合酶和一对引物，所述引物与靶核酸的序列可特异性杂交，其中所述聚合酶为具有3’-5’外切活性的聚合酶，并且所述一对引物中的至少一个为报告引物，其特征在于：所述报告引物的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，所述报告基团的信号被淬灭基团淬灭，并且所述报告引物的3’端的两个或两个以上核苷酸与靶核酸的序列错配，所述报告基团标记在错配的核苷酸上。