[发明专利]一种CD81和OCLN双转基因小鼠及其构建方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，具体的说涉及一种CD81和OCLN双转基因小鼠及其构建方法和用途。

背景技术

丙型肝炎在全世界广泛流行，目前约有1.3-1.7亿丙型肝炎患者。近80%HCV感染人群形成慢性感染，其中一部分慢性丙肝将进展为肝纤维化、肝硬化和肝癌。HCV有不同的亚型，不同人种间流行亚型不同，不同亚型对现有临床治疗的响应性不一样。目前尚没有HCV疫苗。因此，如何有效预防和治疗丙型肝炎仍是亟待解决的重大卫生与健康问题。

HCV感染和致病机制的基础研究，药物和疫苗开发均依赖于合适的动物模型。除了人类之外，黑猩猩也对HCV易感。但黑猩猩数量少，繁殖慢，使用费用高，灵长类动物福利和伦理问题复杂，且不能反映慢丙性病型肝炎的病理，黑猩猩被用于研究的范围有限，人们从黑猩猩感染模型获得丙型肝炎相关理论和技术的突破受到极大限制。国内外学者针对开发丙型肝炎的小动物模型的研究也取得了一定的进展，包括：

（1）全长转基因小鼠：有HCV小鼠模型通常是将HCV全长基因组或者特定蛋白的片段通过转基因的方法整合到小鼠基因组中，构建持续性表达HCV蛋白的转基因小鼠(Moriya et al.,1998)。HCV基因通过转基因技术在小鼠体细胞中超量表达，会对宿主细胞造成表达压力。这类小鼠模型只表达HCV基因片段，缺乏HCV病毒颗粒侵入细胞和在细胞中复制的过程，因此其应用非常有限。

（2）树鼩模型：树鼩能被丙型肝炎病毒侵染(Tong et al.,2011;Xu et al.,2007)。但属于一过性感染，无法建立稳定可重复的感染；树鼩动物本身为野生动物，不易饲养和繁殖，遗传品系不稳定，无法长期、稳定研究和利用。

（3）嵌合体小鼠模型：在免疫缺陷小鼠中移植人肝细胞或在肾包膜下包埋人源肝组织的小鼠，虽能够支持丙型肝炎病毒的有限感染和复制，但病毒感染效率低，人肝组织或细胞免疫排斥反应大，缺乏针对丙型肝炎病毒的免疫病理反应。例如，在严重免疫缺陷型（severe combined immunodeficiency,SCID）小鼠中，白蛋白启动子（肝脏特异表达）控制尿激酶型纤溶酶原激活基因（urokinase-type plasminogen-activator gene,uPA）的表达，肝脏特异表达的uPA将造成持续性的小鼠肝损伤，将人的肝细胞移植到小鼠中，即可建立人肝细胞嵌合的小鼠模型(Kaul et al.,2007)。

（4）自身免疫系统严重缺陷并移植了人肝细胞和人免疫系统的小鼠，丙型肝炎病毒能有限感染及伴随部分肝炎病理，但技术复杂，严重免疫缺陷小鼠不易获得，整个人源化操作不稳定，又牵涉到伦理问题。例如，在免疫缺陷型的Balb/CRag2^-/-Il2rg^-/-小鼠中，白蛋白启动子控制FK506结合蛋白与caspase8融合蛋白特异性在小鼠肝细胞中表达，造成可诱导性肝细胞损伤，诱导后可接受人源肝细胞移植(Washburn et al.,2011)。

（5）研究表明，丙型肝炎病毒感染的种属特异性取决于其侵染特异性受体。在细胞水平已证明，转入人源丙型肝炎病毒的细胞受体CD81（Clusters of Differentiation 81：分化抗原81）和OCLN（Occludin：闭合蛋白）的小鼠细胞能支持病毒感染和复制。利用腺病毒载体携带CD81和OCLN在鼠肝细胞瞬间表达后，可检测到丙型肝炎病毒在小鼠肝细胞中的复制，但不能建立感染和引起肝炎病理变化。例如，将四个HCV受体基因通过腺病毒载体表达于小鼠体内，能使HCV能够进入小鼠细胞并复制。但HCV在这个模型中无法完成复制生活周期，也无法观察丙型肝炎的病理进程(Dorner et al.,2011)。

发明内容

本发明首先提供了一种CD81和OCLN双转基因小鼠，该转基因小鼠是通过如下方法建立的：

（1）将人CD81、OCLN基因克隆，分别插入pLIVE载体，获得含有CD81基因的表达载体pLIVE-CD81和含有OCLN基因的表达载体pLIVE-OCLN；

（2）CD81和OCLN双转基因小鼠的构建；

将载体pLIVE-CD81和pLIVE-OCLN分别进行酶切，分别得到含有CD81和OCLN基因的线性DNA片段；

将线性DNA片段注射入ICR小鼠受精卵；

受精卵随后移植入ICR雌鼠子宫；

小鼠出生后经基因组PCR方法鉴定，分别获得CD81和OCLN的建系小鼠；