[发明专利]保持黄孢原毛平革菌菌体形态的胞外聚合物的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及胞外聚合物提取领域，尤其涉及一种保持黄孢原毛平革菌菌体形态的胞外聚合物的提取方法。

背景技术

黄孢原毛平革菌由于其独特的对异生物质的处理能力，既能处理难降解有机污染物的污染，也能应用于重金属污染的治理，其逐渐成为环境生物处理技术的研究热点。胞外聚合物（EPS）是一类由微生物本身代谢所产生的具有黏性和保护作用的基质，通常附着在微生物细胞外围。胞外聚合物主要是由多聚糖类和蛋白质类物质组成，在保持微生物细胞形态、为胞外酶提供反应场所、生物体之间的相互连接，尤其在利用微生物处理污染物等方面起着重要作用。因此，有效、完整地提取黄孢原毛平革菌的胞外聚合物对于推进黄孢原毛平革菌处理污染物的胞外作用机制的研究具有重要意义。对于黄孢原毛平革菌的胞外聚合物的提取已有一些研究，但总体来看，在胞外聚合物的提取过程中黄孢原毛平革菌菌体都存在一定程度的损伤，如细胞破裂、菌体水解及扭曲变形等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种步骤简单、可行、有效，不造成细胞破裂、菌体水解，保持黄孢原毛平革菌菌体形态的胞外聚合物的提取方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种保持黄孢原毛平革菌菌体形态的胞外聚合物的提取方法，包括以下步骤：

（1）预处理：混合戊二醛溶液和黄孢原毛平革菌菌体，所述戊二醛溶液的浓度优选为0.01～0.012g/mL，每1g湿重的黄孢原毛平革菌菌体中戊二醛溶液的添加量优选为80～100mL，保温，戊二醛溶液和黄孢原毛平革菌菌体的保温温度为0～4℃，保温时间为4～6h；将上述保温后的混合物过滤分离，无菌水冲洗，得保温后的黄孢原毛平革菌菌体；将保温后的黄孢原毛平革菌菌体和无菌水混合，保温，保温后的黄孢原毛平革菌菌体和无菌水的保温温度为30～35℃，保温时间为1～2h，得混合液。

（2）离心处理：将步骤（1）得到的混合液进行高速离心分离，得上清液，离心处理的转速控制在10000～12000rpm，离心处理的时间为10～12min。

（3）透析：将步骤（2）得到的上清液放置入分子截留量为3500～7000kDa的透析袋中进行透析，得到胞外聚合物，透析温度为0～4℃，透析时间为24～48h。本发明中使用的透析袋规格优选为截留分子量为3500～7000kDa，既能达到净化生物化学分析过程中的化学干扰源的目的，又使得透析过程对胞外聚合物提取量的影响达到最小，以提取更多的胞外聚合物。

上述本发明的的提取方法中，黄孢原毛平革菌菌体的制备方法可采用如下步骤制得，将黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)菌株（如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)BKMF-1767菌株，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC AF96007，市购）接种于土豆琼脂培养基，在25～30℃的温度条件下培养5～7天；刮取上述土豆琼脂培养基上的孢子溶于无菌水中制成孢子悬液并接种到液体培养基，在30～35℃的温度、120～150rpm的转速条件下振荡培养5～7天；将上述振荡培养后的菌体与培养液进行过滤分离，并用无菌水冲洗，得到黄孢原毛平革菌菌体。

上述本发明的的提取方法中，孢子悬液是黄孢原毛平革菌经过5～7天的传代培养后产生的孢子制成的悬液。

上述本发明的的提取方法中，振荡培养后的菌体是孢子悬液经过5～7天的振荡培养生长至对数期中后期的菌体。

步骤（1）中无菌水的冲洗次数为1～2次，无菌水冲洗的目的在于去除吸附在黄孢原毛平革菌菌体上多余的戊二醛溶液，避免其对胞外聚合物中各类物质的测定产生影响。

黄孢原毛平革菌菌体培养过程中无菌水的冲洗次数为1～2次，无菌水冲洗的目的在于去除吸附在黄孢原毛平革菌菌体上的液体培养基，避免其中的糖类物质对提取到的胞外聚合物产生影响。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明利用了戊二醛溶液保护菌体形态的作用，具体来说是先用戊二醛溶液对黄孢原毛平革菌菌体进行预处理，再提取胞外聚合物，解决了现有提取胞外聚合物的方法中存在的易造成的细胞破裂、菌体水解及扭曲变形等菌体受损问题。本发明不仅对黄孢原毛平革菌菌体形态具有保护作用，能够保持其原有形态，而且还能更完整、最大量的提取到其胞外聚合物。

附图说明

图1为本发明的不做任何处理的黄孢原毛平革菌菌体的微观结构扫描电镜图。