[发明专利]一种用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对及其应用

说明书

技术领域

本发明属于病毒核酸检测领域，特别涉及一种用于单管二重一步法鉴别手足口病病原CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对，还涉及该利用该引物的应用。

背景技术

手足口病（hand foot and mouth disease，HFMD）是由肠道病毒引起的急性传染病，主要发生于3岁以下儿童，临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹。2012中国疾病控制中心公布全国共发生手足口病2198442例，死亡709人。引起手足口病的肠道病毒有多种，如柯萨奇病毒A组的16、4、6、10、12，柯萨奇病毒B组的2、3、5，埃可病毒的4、19、30，以及肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）等。在我国，根据以往的流行病学监视，EV71和CVA16是引起手足口病爆发的主要病原，在不同年份、不同地点循环反复出现，但2011年9-12月其他肠道病毒构成明显增加。Yang F等对中国不同地区手足口病进行研究，发现CVA6（柯萨奇病毒A6型）和其他肠道病毒感染有增加趋势。Lu QB等人发现肠道病毒CVA6和CVA10可能成为中国手足口病新的流行病原。2012年8-12月江西九江市爆发手足口病，本实验室在九江共收集到704份（每人一份）手足口病咽拭子标本和200份病人血清，通过RT-PCR检测咽拭子标本，测序证实CVA6感染512份。我国CVA6引起的手足口病正在逐年增多，病情复杂，而且在我国九江地区已出现爆发流行。由于其他地区的人群缺少CVA6的抗体，再加上不同地区的人员流动大，很可能会向其他地区扩散。CVA6已逐渐成为引起手足口病爆发的主要病原之一。

CVA6感染和其他肠道病毒感染在临床症状上差别较大，CVA6感染患者分布部位广，均出现手足口和臀部密集的大疱状皮疹，还可伴指甲脱落和指端皮肤表层脱皮，此外呼吸道症状、消化道症状、肝功能受损较EV71、CVA16型多，但是心血管和神经系统的损害较少、较轻。早期、快速、简便、准确地鉴别CVA6型和非CVA6型手足口病，对于积极的临床救治和疫情防控具有重要意义。

传统的病原学诊断采用细胞培养分离和鉴定病毒的手段，耗时且操作复杂，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。分子生物学的进展开拓了肠道病毒的快速诊断技术，特别是PCR技术，由于其具有检测材料用量少、快速、灵敏度高、特异性好等特点，在病毒感染的诊断中发挥越来越重要的作用。RT-PCR技术已成为手足口病病原体快速诊断的重要手段，市场上已有EV71、CVA16和肠道病毒（EV）的商业化PCR试剂盒，但特异性诊断CVA6的PCR试剂盒尚未出现。此外，只检测一种病原的RT-PCR，很容易造成其它病原体的漏诊；若要同时检测多种病原，则每个检测都要单独进行，要使用多个PCR管，繁琐费时、试剂消耗大、操作步骤多、容易造成实验失败和PCR污染。如能建立一种特异性好、灵敏度高的单管二重一步法RT-PCR，鉴别CVA6型和非CVA6型手足口病，将具有广泛的应用前景。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物。

本发明的第二目的在于提供上述引物在单管二重一步法检测CVA6和非CVA6肠道病毒中的应用。

技术方案：本发明提供的一种用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对，包括：

上游引物序列为：5’-TCGAAATGGGGTTAATGAGGCG-3’；

下游引物序列为：5’-CRCCTTCATAATCMGTGGTGG-3’；

其中R为A或G，M为A或C。

本发明还提供了一种用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的双重一步法引物，包括权利要求1所述的RT-PCR引物对以及肠道病毒通用引物。

其中，所述肠道病毒通用引物为：

引物F序列为：5’-TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3’；

引物R序列为：5’-ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3’；

其中，W为A或T。

本发明还提供了上述用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对在CVA6和非CVA6肠道病毒检测中的应用。

本发明还提供了一种包括权利要求1所述的用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对的试剂盒。