[发明专利]庆笙红球菌及其在制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一株新的菌株——庆笙红球菌（Rhodococcus qingshengii）ZJB-12028，以及该菌株在微生物不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯制备阿托伐他汀关键手性中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

（二）背景技术

(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（Ethyl(S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate,(S)-CHBE）是一种重要的手性药物中间体，可用于合成他汀类药物—羟甲基戊二酰CoA（HMG-CoA）还原酶的竞争性抑制剂，可以抑制肝脏中的胆固醇的合成，从而降低血液中胆固醇的含量，降低心脑血管疾病的发病机率，其药物商品名立普妥（阿托伐他汀钙）是美国第一个年销量超过一百亿美元的药物，目前也是全球最高销量的药物。另外，(S)-CHBE还可以转化生成1，4-二氢吡啶类β-阻滞剂，后者是一种抗高血压药物的有效成分。因此，制备光学活性(S)-CHBE备受研究者的关注。以下是(S)-CHBE分子结构式：

(S)-CHBE的制备方法可以分为外消旋体拆分法和不对称催化合成法。由于外消旋体拆分的方法制备效率不高，理论收率仅为50％，且产物的分离纯化困难，因此，对于外消旋体的手性拆分制备(S)-CHBE意义不大。与拆分法相比较而言，采用不对称合成(S)-CHBE受到了更多的关注。以潜手性底物4-氯乙酰乙酸乙酯（Ethyl4-chloroacetoacetate，COBE）为原料，不对称催化合成单一手性对映体(S)-CHBE可以解决拆分法获得(S)-CHBE中的过程复杂，单一对映体过量值低等问题，同时由于底物COBE价格便宜，容易合成，因此不对称合成法是最经济有效的合成(S)-CHBE方法。

以COBE为原料不对称合成制备(S)-CHBE，可分为化学催化法和生物催化法两类。化学催化法是采用手性的钌化合物（例如RuX₂[(S)-BINAP]）作为催化剂不对称加氢还原，产物的e.e.值可达97%以上，但这种方法需要高压加氢，对反应器要求较高，而且所用催化剂价格昂贵，因此生产成本较高。而采用的生物催化剂无需苛刻的反应条件，也不需要昂贵的催化剂，因此有较好的应用前景。生物催化过程中，采用纯酶催化需要添加昂贵的辅酶，因此，大规模的生产通常采用具备辅酶再生系统的微生物细胞作为催化剂。生物法羰基不对称还原制备(S)-CHBE具有反应条件温和，产物单一，立体选择性高，在未来的绿色化学的发展过程中有重要的利用开发价值。

（三）发明内容

本发明目的是提供一株新菌株——庆笙红球菌（Rhodococcus qingshengii）ZJB-12028，及其在羰基不对称还原制备(S)-CHBE中的应用，该菌株稳定性好，立体选择性严格，产物光学纯度高。

本发明采用的技术方案是：

庆笙红球菌（Rhodococcus qingshengii）ZJB-12028，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2013年9月4日，保藏编号CCTCC NO:M2013390。

该新菌株特征如下：

菌落形态：28℃条件下培养24h，菌落呈圆形，中央隆起呈凸镜状，直径2～3mm，乳白色，不透明，表面光滑湿润，边缘整齐，略带锯齿状，易挑起。

生理生化特征：革兰氏阳性，接触酶阳性，利用APICoryne自动微生物鉴定系统对菌株进行了生理生化检测表明菌株ZJB-12028为红球菌属（Rhodococcus），具体特征见表1。

表1：菌株ZJB-12028的生理生化鉴定结果

Notes:+,positive;-,negative;

16S rDNA序列鉴定：以提取到的细胞总DNA为模版，利用通用引物P1和P2扩增菌株的16S rDNA基因，再将PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。菌株ZJB-12028经PCR扩增获得一段长约为1.5kb的片段，经测序确认该菌株16S rDNA的扩增产物实际长度为1422bp，序列如SEQ ID No.1所示：