[发明专利]G6PDH基因在提高黑根霉对甾体C11α-羟基化能力中的应用及菌株

说明书

（一）技术领域

本发明涉及G6PDH基因在提高黑根霉对甾体C11α-羟基化能力中的应用，以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因工程菌的构建方法，以及构建并筛选获得的一株甾体C11α-羟基化较高的菌株——黑根霉（Rhizopus nigericans）PIe。

（二）背景技术

氧化还原酶催化合成的产物被广泛应用于医药、食品、农药等领域，酶催化过程中辅酶不足是限制大多数氧化还原酶进行生物催化合成产物的主要因素。因此，辅酶循环再生对于酶催化过程显得非常重要，进而在医药食品等相关的产品生产中体现重大的价值。文献报道辅酶的再生方法包括酶法、光化学、电化学等再生方法，其中尤以酶法再生受到广泛重视。常用于辅酶再生的酶有醇脱氢酶（ADH）、甲酸脱氢酶（FDH）、葡萄糖脱氢酶（GDH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）、亚磷酸脱氢酶（PTDH）等，其中FDH和GDH的研究和应用较多，例如，Sheldon研究E.coli JM109（pGDA2）过量表达来自于Bacillus megateriumIWG3葡萄糖脱氢酶基因，当提供NADP+和葡萄糖时，E.coli JM109（pGDA2）能够作为NADPH的再生系统。ZhinanXu将Bacillus megaterium AS1.223中的葡萄糖脱氢酶基因gdh223通过克隆构建pQE30-gdh223表达载体，并在大肠杆菌中表达，实现由4-氯乙酰乙酸乙酯到（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的转化。相对于FDH和GDH，G6PDH用于辅酶再生的报道相对较少。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH，EC1.1.1.49）是戊糖磷酸途径（PPP）氧化阶段中催化第一步反应的酶和PPP代谢途径调控中的一个关键调控酶。G6PDH广泛存在于包括细菌、植物、动物等各种生物细胞中，其催化的反应产生大量的还原型辅酶NADPH，NADPH作为负氢离子供体提供还原力，满足许多细胞代谢过程的需要，如脂肪酸固醇类的合成，光合作用中由CO₂合成葡萄糖，核酸合成，维持红细胞中还原型谷胱甘肽水平等，因而G6PDH所催化的反应在还原性生物合成中具有重要的作用。此外，G6PDH还与细胞生长发育，溶血性贫血症、植物胁迫应答、心血管疾病，肿瘤等许多人类疾病有关。

甾体化合物具有抗炎、抗真菌、免疫抑制、利尿、避孕等作用^[76]，临床应用广泛，需求量大，已成为医药行业中仅次于抗生素的第二大类药物，甾体羟基化中C₁₁α-羟基化是极其重要的甾体反应之一，通过C₁₁α-羟基化引入高生理活性基团，可以显著提高甾体药物的疗效，减少副作用，改变作用的专属性等。1952年Peterson和Murry等首次利用黑根霉一步转化实现孕酮C₁₁α-羟基化生成C₁₁α-羟基孕酮，促进了可的松药物的的产业化，随后，微生物转化甾体在甾体药物的生产中越来越受到重视。经过近几十年的研究，黑根霉生物转化甾体C11α-羟基化工艺和技术已相对较成熟，通过诱变育种改善了菌株转化能力，所以在现有菌株和工艺基础上很难继续提高转化率，如何采用新的方法进一步改进菌株的生产能力就成为该领域人员尤为关注的问题。

（三）发明内容

本发明目的是通过分子生物学方法将G6PDH克隆至黑根霉中，改造菌种，拟在改造后的黑根霉细胞内实现G6PDH催化NADPH再生，向细胞色素P450酶系催化的反应提供所需要的辅酶，改善黑根霉对甾体C11α-羟基化的能力。

本发明采用的技术方案是：

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）基因在提高黑根霉对甾体C11α-羟基化能力中的应用。

具体的，所述应用为：构建含有G6PDH基因的表达载体，将其导入黑根霉中，筛选阳性克隆，获得对甾体C11α-羟基化能力提高的基因工程菌。

具体的，所述G6PDH基因序列如SEQ ID No.1所示：