[发明专利]一种用于检测鸡乌肤位点基因型的引物、试剂盒及检测方法有效
| 申请号： | 201310509015.6 | 申请日： | 2013-10-24 |
| 公开（公告）号： | CN103571952A | 公开（公告）日： | 2014-02-12 |
| 发明（设计）人： | 康相涛;韩瑞丽;杨朋坤;王丹丹;李转见;田亚东;蒋瑞瑞;孙桂荣;吕世杰;李国喜;闫峰宾;王彦彬;刘小军;许殿明;李孝法;索智勇;曹向阳 | 申请（专利权）人： | 河南农业大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64 |
| 代理公司： | 郑州睿信知识产权代理有限公司 41119 | 代理人： | 牛爱周 |
| 地址： | 450002*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 用于 检测 鸡乌肤位点 基因型 引物 试剂盒 方法 | ||
1.一种用于检测鸡乌肤位点基因型的引物，其特征在于：包括引物对P：
上游引物P-F：5’-CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3’；
下游引物P-R：5’-ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3’。
2.一种用于检测鸡乌肤位点基因型的试剂盒，其特征在于：主要包括引物对P：
上游引物P-F：5’-CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3’；
下游引物P-R：5’-ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3’。
3.根据权利要求2所述的用于检测鸡乌肤位点基因型的试剂盒，其特征在于：还包括荧光定量PCR2×缓冲液、灭菌超纯水和荧光定量标准品。
4.一种检测鸡乌肤位点基因型的方法，其特征在于：包括以下步骤：以包含EDN3基因的待测鸡全血基因组DNA为模板，以引物对P为引物进行荧光定量PCR扩增，扩增片段的DNA序列如SEQ ID No.3所示；
所述的引物对P为：
上游引物P-F：5’-CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3’，
下游引物P-R：5’-ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3’。
5.根据权利要求4所述的检测鸡乌肤位点基因型的方法，其特征在于：所述的荧光定量PCR扩增反应体系为：荧光定量PCR2×缓冲液10μL，ddH2O7μL，P-F0.5μL，P-R0.5μL，DNA模板2μL。
6.根据权利要求4所述的检测鸡乌肤位点基因型的方法，其特征在于：所述的荧光定量PCR扩增反应程序为：95℃预变性2min；40个循环：95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min；20℃保存。
7.根据权利要求4所述的检测鸡乌肤位点基因型的方法，其特征在于：还包括以下步骤：利用标准曲线求得待测鸡EDN3基因的相对拷贝数，根据其相对拷贝数鉴定鸡乌肤位点的基因型。
8.根据权利要求7所述的检测鸡乌肤位点基因型的方法，其特征在于：所述的标准曲线的制作方法为：以白肤鸡全血基因组DNA作为荧光定量标准品，浓度分别为80，40，20，10，5，2.5ng/μL，以引物对P为引物进行荧光定量PCR扩增，以上述六个标准品的Ct值为纵坐标，以浓度的对数值为横坐标，建立标准曲线，求得标准曲线方程。
9.根据权利要求7所述的检测鸡乌肤位点基因型的方法，其特征在于：所述的利用标准曲线求待测鸡EDN3基因的相对拷贝数的方法为：荧光定量PCR扩增前，先将待测鸡的DNA稀释到同一浓度10ng/μL，再将待测鸡的Ct值代入标准曲线方程中，求出其对应的对数浓度，再转化为浓度，即为该待测鸡EDN3基因的相对拷贝数。
10.根据权利要求7所述的检测鸡乌肤位点基因型的方法，其特征在于：所述的根据相对拷贝数鉴定鸡乌肤位点的基因型的方法为：当待测鸡EDN3基因的相对拷贝数为2时，该个体为乌肤纯合子；当待测鸡EDN3基因的相对拷贝数为1.5时，该个体为乌肤杂合子；当待测鸡EDN3基因的相对拷贝数为1时，该个体为非乌肤纯合子。
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