[发明专利]猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种可以区分变异和经典猪流行性腹泻病毒的双重荧光定量PCR引物和探针。

背景技术

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea, PED）是由套式病毒目冠状病毒科、冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种猪肠道传染病，以水样腹泻、呕吐和脱水为特征（Takahashi K, Okada K, Ohshima K.An outbreak of swine diarrhea of a new type associated with coronavirus-like particles in Japan[J].Vet Sci, 1983,45:829-832; Murphy FA, Fauquet C M. smith Report of the ICTV[J], Archives virology suppl,1995,10: 407-409.；殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社，1997. 681-688.）。各种日龄的猪均可感染，哺乳仔猪、断奶仔猪的发病率可达100%，尤其哺乳仔猪受害最为严重，此病多发生于寒冷季节。20世纪70年代最初发现于英国（李连敏，裴爱民.秋冬季谨防猪流行性腹泻病[J].南方养猪，2006, 209: 44.；林初文，庄金秋，谢印乾.我国主要猪病毒性腹泻疾病的特点及其防治对策[J].中国畜牧兽医，2007, 34 (5): 121-122.）。随后，许多国家如比利时、德国、加拿大、法国、日本等国也都出现了PED流行的报道（蔡宝祥.介绍几种新近发现的猪传染病[J].畜牧与兽医，1982, 5: 218-221.；Pensaert M B, de Bouck P. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J]. Arch Viorl, 1978, 58:237-243.），我国从20世纪80年代初开始陆续有本病的流行报道，并且给我国的养猪业带来了巨大的损失（倪艳秀，林继煌，何孔旺等.猪流行性腹泻研究概况〔J].畜牧与兽医，2001, 33 (1): 38-40.）。

PEDV 属于冠状病毒属 I 群，是 RNA 病毒，基因组为单股正链，不分节段。基因组包含 6个开放读框(ORF)，从5’到3’顺序依次为ORF1（20346 nt）；S 基因（4152 nt）；ORF3 基因（675 nt）；E 基因（231 nt）；M 基因（681 nt）和 N 基因（1326 nt）（Kocherhans et al., Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus (PEDV) genome sequence[J].Virus Genes. 2001, 23(2): 13-144.; Brian et al., Coronavirus genome structure and replication. Curr Top Microbiol Immunol. 2005, 287: 1~30.）。

目前针对PEDV的实验室诊断方法有病原学方法、基于病毒抗原或抗体的免疫学方法和针对病毒RNA核酸检测技术（邓小红，吕立新，陶庆园等.猪病毒性腹泻病的实验室诊断[J].畜禽业，2004,165 (1): 49-50.）。传统的病原学方法主要通过细胞进行病毒的分离，耗时、耗力。用免疫学检测抗体可以了解病毒感染以及疾病发生、发展的过程，然而，由于抗体只有在病毒感染至一定时期后才会出现，因此抗体检测在作为快速防控的方法时存在一定局限性。荧光定量PCR以特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快的诸多优点成为分子生物学研究中的重要工具。

目前，PEDV在中国大陆仍然存在大规模发生的情况，给中国的养猪业带来巨大损失。有学者对此次流行的PEDV毒株以及其基因变异情况进行了详细的分析（Pan Y et al., Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China[J]. Virol J. 2012,Sep 12;9:195.），发现变异毒株和经典PEDV毒株之间S基因有较大的不同，可以作为区分两种毒株的特征基因，但目前还未有针对此的荧光定量鉴别诊断方法出现。

发明内容