[发明专利]一种快速检测青枯菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种快速检测青枯菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。

背景技术：

植物青枯病是由青枯菌Ralstonia solanacearum(Smith)Yabuuchi et al引起的一种维管束病害，可侵染多种植物如花生、桉树、木麻黄等，给农业和林业生产造成了很大的经济损失。青枯病不仅可通过发病植株传播，也可通过潜伏侵染植株传播。与发病植株比起来，潜伏侵染植株的传播作用更加有威胁。发病植物从外观上容易辨认，可通过加强植物检疫进行防控，然而，处在青枯病潜伏期的植物从外观上很难与正常植株分开，所以潜伏期植物对青枯病的传播作用应该更加引起重视。

目前，植物组织中青枯菌的检测主要沿用传统的分离培养方法，需要进行纯培养和生化鉴定等多个步骤，检测周期长，灵敏性低，不能实现大批量植物组织的快速检测，特别是组培苗的快检。近年来发展的PCR技术虽能提高检测效率，但是需要专用PCR仪和专业操作人员和电泳观测结果，在基层的林业部门难以大规模推广应用。

LAMP技术是2000年Notomi等开发的一种新型核酸扩增技术，针对待测靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，在65℃左右等温条件1h内可以进行特异高效快速的核酸扩增，达到10⁹拷贝，扩增结果可直接观察焦磷酸镁沉淀或者加入显色剂进行判断。LAMP方法与PCR技术相比，检测时间短，具有更高的灵敏度和特异性，操作简单，仅仅需要普通水浴锅就可以完成检测。近年来已广泛用于各种病原检测。尽管已有针对青枯菌Flic基因建立LAMP方法的文献报道，但是由于仅用于水样品，且灵敏度有限，以此建立的LAMP方法在实际应用中具有一定的局限性。

发明内容：

本发明的目的是提供一种快速、特异好、灵敏高的利用环介导等温扩增检测青枯菌的检测引物组，利用该检测引物组可以特异性的检测青枯菌。

本发明的利用环介导等温扩增检测青枯菌的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：

上游外引物F3（5’-3’）：GGATTAATTCGATGCAACGC（如SEQ ID NO.1所示）；

下游外引物B3（5’-3’）：CTTCCTCCGGTTTGTCAC（如SEQ ID NO.2所示）；

上游内引物FIP（5’-3’）：GCAGCACCTGTGTCCACTTACATGCCACTAACGAAGC（如SEQ ID NO.3所示）；

下游内引物BIP（5’-3’）：CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGTAGCAACTAGAGACAAGG（如SEQ ID NO.4所示）。

本发明的第二个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的青枯菌的检测方法，其特征在于，提取样品中的细菌DNA，然后通过环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。

所述的样品可以为植物组织或者细菌培养物。

所述的通过环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增具体为：环介导等温扩增体系为体系总体积25μL，包括2.5μL10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL10mM dNTPs、0.5μL10uM上游外引物F3、0.5μL10uM下游外引物B3、1μL40uM上游内引物FIP、1μL40uM下游内引物BIP、0.6μL100mM MgSO₄、12.5μL2M甜菜碱、4μL灭菌双蒸水ddH₂O，1μL8U/μL Bst DNA聚合酶和1μL细菌DNA模板，反应条件为在温度为60～65℃孵育45～60min。

所述的确认是否存在有扩增产物可以利用电泳检测、荧光显色检测或浊度检测环介导等温扩增反应产物是否具有扩增产物，优选用荧光显色检测，具体是在80℃终止反应1～2min，在扩增反应管中加入SYBR GreenⅠ显色剂，1～5min后观察结果，如果颜色为橙色，则样品青枯菌阴性，无青枯菌，如果颜色为绿色，则样品青枯菌阳性，含有青枯菌。