[发明专利]一种重组猪干扰素β1-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组猪干扰素β1-Fc融合蛋白及其编码基因，以及其表达、纯化和包涵体复性方法。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据IFN的来源即动物种类、细胞类型、诱生剂的性质和诱生条件不同，可分为α、β、γ三种。其中，干扰素-β主要由成纤维细胞产生，在体内具有增强细胞表面HLAI、Ⅱ类抗原表达，提高血清新蝶吟和β₂-微球蛋白水平、增强NK细胞活力和ADCC作用以及外周淋巴细胞2’，5’-寡腺昔合成酶活性。临床已将干扰素-β应用于病毒感染和肿瘤疾病的治疗中。

我国是生猪养殖大国，猪圆环病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病等多种猪病毒性传染病给养猪业带来了巨大的经济损失。目前我国虽广泛接种各种猪病疫苗，仍不能有效控制疾病流行。干扰素β具有较强的抗病毒效应及免疫调节活性，因此在兽药领域中的应用越来越广泛。在不同类型的干扰素中，干扰素β比干扰素α具有更好的抗SARS-CoV效果，而干扰素β在酸、碱、热的稳定性也明显优于干扰素α。然而，干扰素β种属差异较大，仅依靠在活猪体内提取远远不能满足市场的要求。动物用基因工程干扰素β无药物残留、无副作用，很受临床兽医和养殖户的青睐，但是市场上多数类似药物依然面临着产量不足、质量层次不齐、价格昂贵等问题。

另一方面，作为小分子量蛋白，猪干扰素β1也与其他干扰素β一样，存在血浆清除速度较快的缺陷，从而导致在临床治疗中需要重复多次用药才能达到治疗效果。同样，半衰期短及用药的频繁也将成为使用猪干扰素β1治疗猪病毒性疾病的瓶颈。IgG免疫球蛋白是人和动物体内的主要抗体，它在体内的半衰期约为20天。其稳定性是由于IgG的Fc片段可与新生Fc受体（FcRn）结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。有鉴于此，本发明尝试考虑在猪干扰素β1上增加IgG的Fc片段来构成融合蛋白，以提高猪干扰素β1体内半衰期，达到长效的目的。但是，一般来说，在小分子蛋白上增加IgG的Fc片段后都会使得蛋白的生物活性有很大程度的降低。由此，本发明的目的是提供一种既能保留猪干扰素β1原有活性，又可以延长体内半衰期的猪干扰素β1与Fc片段的融合蛋白。

然而，通过大肠杆菌表达的重组蛋白多为不溶解、无活性的细胞内聚集物，即包涵体。包涵体的复性是一个非常复杂的过程，如果复性条件不适宜将会出现分子内二硫键的错配，分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，一方面降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合格，同时又产生沉淀析出，影响得率。因此，本发明所要解决的另一个技术问题是采用合适的方法将大肠杆菌表达的蛋白包涵体复性为具有生物活性的蛋白。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，通过密码子优化的方式，提供一种可在大肠杆菌内高效表达的重组猪干扰素β1-Fc融合蛋白以及其基因和表达、纯化、复性方法。

本发明提供了重组猪干扰素β1-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包括猪干扰素β1部分和Fc片段部分，其中，猪干扰素β1部分为猪干扰素β1胞外区的全部序列，Fc片段部分包括铰链区、CH2区和CH3区，猪干扰素β1与Fc片段部分之间为直接融合。

其中的Fc片段选自人或动物的免疫球蛋白Fc，是Fc全长或是部分序列，Fc选自IgG、IgM、IgD、IgA，每种免疫球蛋白类型包括各亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。本发明的融合蛋白中的Fc片段部分特别优选来自猪的IgG1。

优选地，本发明的重组猪干扰素β1-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第2-165位氨基酸残基为猪干扰素β1的胞外区序列，第166-395位氨基酸残基为猪IgG1序列。

本发明提供了编码上述所述重组猪干扰素β1-Fc融合蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主菌中的表达。

本发明还提供了包含了上述所述编码重组猪干扰素β1-Fc融合蛋白的基因的质粒，所述的质粒优选为原核表达质粒，最优选为pET21b载体。

本发明还提供了包含有上述所述质粒的大肠杆菌菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌BL21（DE3）菌株。

本发明还提供了重组猪干扰素β1-Fc融合蛋白在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤：