[发明专利]一种具有免疫调节活性的重组蛋白ASPPR及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫活性蛋白ASPPR，其表达纯化方法以及其作为免疫调节剂的应用，属于分子生物学和免疫学技术领域。

背景技术

疫苗接种是预防传染病的最有效的途径。现代疫苗已经不仅限于疾病的预防，还广泛用于传染病的治疗及非传染病例如癌症的治疗。传统疫苗主要包括减毒活疫苗和灭活疫苗，新型疫苗包括亚单位疫苗（subunit vaccine）、结合疫苗、合成肽疫苗、基因工程疫苗。新型基因工程疫苗纯度高、特异性强，但分子小，免疫原性相对较差，难以产生有效的免疫应答，需要佐剂来增强其免疫原性或宿主对抗原的保护性应答。由于机体对不同病原体的保护性免疫应答是不同的，研发能诱导针对不同病原保护性应答的疫苗需要不同的佐剂。一直广泛应用于人群疫苗的、美国FDA批准的铝盐佐剂对于许多新型疫苗佐剂活性较差，尤其是其诱导的细胞免疫较弱，对于小分子的抗原无佐剂活性，不能满足新型疫苗发展的需要。因此，新佐剂的研发对于新型疫苗的研发具有重要意义。

新型疫苗佐剂的组成形式多样,来源也不同,主要包括油/水乳剂型、颗粒型、微生物衍生物型佐剂等。迄今为止,已批准上市的新型疫苗佐剂仅有少数几种：MF59、AS04等。MF59是一种由Chiron公司研发的水包油乳剂,在高压条件下将鲨烯与Tween-80和Span85混合后进行微流化，进而形成均一的小滴状乳液，已在欧洲国家批准用于流感亚单位疫苗。该佐剂比铝盐具有更好的免疫效果，但不良反应增加。AS04是2005年2月葛兰素史克公司研发的，是一种乳剂，其新型佐剂系统AS04的乙型肝炎疫苗Fendrix获欧盟批准上市,安全性良好,但临床报道的局部不良反应与其他乙肝疫苗类似,包括注射部位疼痛、头痛和疲乏。这些油/水乳剂型的佐剂都存在着较明显的不良反应，新兴疫苗的研发需要安全有效并适用于蛋白、多肽等多种形式疫苗的佐剂。

活化相关蛋白（activation-associated proteins,ASP）是线虫体内的一种高免疫原性的蛋白，是重要的保护性抗原。研究发现，一种来自盘尾丝虫的Ov-ASP-1作为一种非毒素类的蛋白具有佐剂活性，具有以下特点：（1）使用方便：无需交联，只需与抗原简单混合即可发挥佐剂活性；（2）诱导平衡的免疫应答：能够激发小鼠产生Th1偏倚的、混合的Th1/Th2免疫应答；（3）适用抗原范围广：不但可以作为蛋白、灭活疫苗的佐剂，而且可以作为多肽抗原的佐剂。

目前有文献报道使用全长为153个氨基酸长度的ASP-1蛋白作为免疫佐剂。但是ASP-1全长蛋白作为佐剂具有以下缺点：（1）蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达，复性困难，产量低，导致生产成本增加，限制其作为佐剂应用于疫苗的可行性。蛋白发挥佐剂活性必须形成正确的空间折叠，但是，该蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达，在复性过程中，大部分蛋白由于不能形成正确折叠，大量析出；每升菌液得到的活性蛋白数量低，导致获得活性蛋白的成本增高，因而限制了其作为佐剂广泛应用于疫苗的可能性。（2）自身免疫原性强，可以诱导针对蛋白自身的较高水平的抗体。产生的高水平抗体一方面有可能降低其佐剂活性；另一方面，可能增强对机体的不良反应。

因此，本发明旨在提供一种佐剂活性高、适用抗原范围广、自身免疫原性弱的疫苗佐剂，以满足高效率疫苗组合物的应用。

发明内容

基于以上目的，一方面，本发明首先提供了一种具有佐剂活性蛋白的活性功能片段，所述蛋白是通过生物信息学分析、设计不同的截短片段、在大肠杆菌中的诱导表达、并经过功能鉴定筛选获得的具有佐剂活性的ASP-1蛋白的活性片段ASPPR，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NOs2所示，其位于ASP-1全长蛋白的第10-153位氨基酸残基位置。

本发明还提供了编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。

在一个优选的技术方案中，所述核苷酸序列如SEQ ID NOs1所示。本发明还提供了一种含有上述核苷酸序列的表达载体。

在一个优选的技术方案中，所述载体为pQE-ASPPR。

另一方面，本发明还提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物含有疫苗活性物质和本发明所提供的作为佐剂成分的上述蛋白质。

在一个优选的技术方案中，所述疫苗活性物质为蛋白质、多肽或DNA。

优选地，所述疫苗活性物质可以为HIV四分支肽或HBsAg。

本发明还提供了所述蛋白ASPPR作为不同形式的抗原/疫苗佐剂的应用，所述应用包括：

（1）ASPPR对蛋白抗原（模式抗原OVA和HBsAg）的佐剂活性；