[发明专利]一种获得紫色叶背草莓植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种产生紫色叶背草莓的方法，特别地，是一种通过基因调控手段产生紫色叶背草莓植株的方法。

背景技术

草莓(Fragaria ananassa Duch)是蔷薇科草莓属多年生草本植物，是一种世界各国广泛栽培的水果，素有水果皇后之称。由于其高杂合性和多倍性，使得杂交育种工作周期长、工作量大。利用基因调控技术培育草莓品种可以定向改良现有品种，大大提高育种效率。将成为草莓品种改良的一种重要手段，目前应用于草莓上的基因导入法主要是农杆菌介导的叶盘法。花青素可以对人体的许多疾病如癌症、心血管疾病和神经性疾病等起防御作用，草莓本身具有完整的花青素合成路径。利用该项技术和方法就可以获得含更多花青素的果实。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros及其构建方法。

本发明的另一个目的是提供一种产生紫色叶背草莓的方法，特别地，是一种通过基因调控手段产生紫色叶背草莓植株的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros，其序列如序列表SEQ ID：No.1所示。

如上所述的植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros，其图谱如图1所示。

一种如上所述植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros的构建方法，包括以下步骤：

第一步，pBI121-del-Tnos表达载体构建

在花青素调控基因del两端引入BamHI和SacI酶切位点，将质粒pBI121-35s-Tnos用BamHI和SacI两个内切酶酶切后回收载体大片段，将del基因的片段，插入pBI121-35s-Tnos的BamHI和SacI位点间，35s启动的del基因表达载体pBI121-35s-del-Tnos构建完成；

第二步，pCAMBIA1301-35s-ros-Tnos表达载体的构建

在花青素调控基因ros两端引入NcoI和BstEII酶切位点,将质粒pCAMBIA301-35S-Tnos用NcoI和BstEII两个内切酶酶切后回收载体大片段pCAMBIA1301-35s-Tnos，将ros基因的片段插入得到用35s驱动的ros基因表达载体pCAMBIA1301-35s-ros–Tnos；

第三步，pCAMBIA2301-del-ros表达载体的构建

将质粒pCAMBIA2301-35S-Tnos用HindIII和BstEII两个内切酶酶切后回收载体大片段pCAMBIA2301-Tnos，将表达载体pCAMBIA1301-35s-ros-Tnos用HindIII和BstEII两个内切酶酶切后回收载体片段-35s-ros-，将载体片段-35s-ros-插入pCAMBIA2301-Tnos的HindIII和BstEII位点之间，得到pCAMBIA2301-35s-ros-Tnos表达载体，将该表达载体用BamHI和KpnI两个内切酶酶切后回收载体大片段pCAMBIA2301-35s-ros-Tnos，将表达载体pBI121-35s-del-Tnos的两端以PCR的方法添加酶切位点KpnI和BglII，酶切后将所得的片段插入由KpnI和BamHI两个内切酶酶切后回收的载体大片段pCAMBIA2301-35s-ros-Tnos上，得到以Kan基因为筛选标记35S分别启动的del、ros基因表达载体pCAMBIA2301-35s-del-Tnos-35s-ros-Tnos，即得植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros。

一种获得紫色叶背草莓的方法，该方法的步骤如下：

A.构建植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros，将其转化根癌农杆菌LBA4404，随后在28℃下在含100mg·L^-1卡那霉素的LB液体培养基中培养12-16小时；

B.将草莓哈尼的组织培养苗在继代培养基上培养30-40天，之后在无菌条件下取组织培养伸展叶片，剪成面积约0.1cm²的叶盘，放在步骤A得到的培养物中3-7分钟，然后接种在再生培养基上，黑暗条件培养下1-2天；