[发明专利]一种表达脂肪酶的黑曲霉菌株

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高效重组表达脂肪酶的黑曲霉突变菌株。

背景技术

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)又名甘油酯水解酶、三酰基甘油酰基水解酶，是指水解羧酸甘油三酯中酯键的酶。脂肪酶能催化甘油三酯来生成甘油二脂、单甘脂、脂肪酸和甘油。脂肪酶具有催化疏水性的油脂变成水溶性的脂肪酸和甘油的生物功能，在无机溶剂中能保持高催化活力和极强稳定性。另外，脂肪酶对底物的广谱性/特殊专一性，赋予了脂肪酶在食品油脂加工工业、洗涤剂工业、酯键化合物的合成和手性药物合成等工业的巨大应用价值。脂肪酶已经成为蛋白酶、淀粉酶之后的第三大工业用酶。

脂肪酶是生物体内一类重要的代谢酶，从催化特性看，它具有高度的化学选择性和立体异构性，且反应不需辅酶，反应条件温和，副产物少。脂肪酶的另外一个特征是可以在异相系统（如油、水界面）或有机相中起作用，在水相中，脂肪酶通常催化水解反应的进行；而在有机相中，它却能催化多种合成反应：如酯化、酯交换、酯的醇解、酯的酸解等。脂肪酶的这些特性使其成为在手性化合物合成中重要的生物催化剂，多被用来催化一些酯类合成和转化反应，在食品增香、脱脂加工、污水处理及化工产品中有着广泛的应用。然而，目前脂肪酶的生产效率仍然较低且生产成本也较高，因此需要对现有的脂肪酶的种类及生产技术进行改进。

脂肪酶广泛存在于动物组织、植物种子和微生物体中。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，因此微生物来源的脂肪酶比动植物来源的脂肪酶具有更广的作用pH、作用温度范围；以及高稳定性、高活性和底物专一性。而且微生物脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品。已经公布的适用于甘油三酯加工的不同来源的脂肪酶有33种，其中18种来自霉菌。但是，用来表达脂肪酶的重组菌株一直存在表达效率低下的问题。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种黑曲霉突变菌株，所述黑曲霉突变菌株是由构建得到的黑曲霉工程菌经紫外诱变获得的，其能大幅度提高脂肪酶的表达量，且不影响重组脂肪酶的酶学性质和应用效果。

本发明首先提供一种黑曲霉重组菌株，所述的重组菌株用于表达序列为SEQ ID NO:2的脂肪酶；

所述的黑曲霉重组菌株中转入了携带有序列为SEQ ID NO:1的表达质粒；

本发明一方面提供了一种黑曲霉突变菌株黑曲霉WLlip1（Aspergillus Niger WLlip1），已于2013年10月18日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013478。

本发明的黑曲霉突变株用于生产脂肪酶。

本发明提供的黑曲霉突变菌株能高效重组表达脂肪酶，其蛋白表达量比突变前菌株提高了约40%，其发酵液的脂肪酶酶活高达5482U/mL，比突变前提高了78%，且突变后重组表达的脂肪酶的酶学性质并未因突变发生变化，最适作用pH均为9.5，最适作用温度均为35℃。WLlip1突变株重组表达的脂肪酶对皮质类污垢具有很强的去污效果，因此可广泛应用于洗涤剂领域。

附图说明

图1：黑曲霉XUJ-2菌株发酵液SDS-PAGE电泳图；

其中，箭头所指32kD附近可以看到清晰的蛋白条带，即为重组脂肪酶。

图2：黑曲霉突变株WLlip1发酵液SDS-PAGE电泳图；

其中，泳道1为对照组XUJ-2菌株的脂肪酶表达情况，泳道2为突变株WLlip1的脂肪酶表达情况；箭头所指32kD附近可以看到清晰的蛋白条带，即为重组脂肪酶。

图3：显微镜下观察黑曲霉菌株形态变化；

其中，A为对照XUJ-2菌丝形态，B为突变株WLlip1菌丝形态。

图4：本发明突变前后黑曲霉菌株发酵液中脂肪酶相对酶活-pH变化曲线。

图5：本发明突变前后黑曲霉菌株发酵液中脂肪酶相对酶活-温度变化曲线。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不仅限于所提供的具体案例，而应包括本领域技术人员在本说明书基础上，不需经过创造性劳动就能扩展的保护范围。

实施例1：重组质粒的构建