[发明专利]一种利用GnRHR基因检测绵羊繁殖力的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记技术，利用GnRHR基因检测绵羊繁殖力的方法以及在选育提高绵羊繁殖力中的应用，具有重要的生产价值。 

背景技术

新疆作为我国的五大牧区，2013年的绵山羊存栏量达4161.52万只，具有丰富的绵羊品种资源，尤其是策勒黑羊、吐鲁番黑羊的优良地方绵羊品种，得到有效利用,因此结合新疆现有种质资源，提高绵羊的良种化程度，加大新疆的羊肉产量，是满足人民群众日益增长的需求的一个有效手段和根本方法。 

促性腺激素释放激素受体（Gonadotropin Releasing Hormone Receptor，GnRHR）是位于垂体促性腺细胞表面的一种高亲和性G蛋白耦联受体，可转导来自细胞外配位体、下丘脑因子下丘脑促性腺激素释放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）的信号，调节垂体前叶合成与释放促黄体素和促卵泡素，从而促进性腺的生长、成熟和调控生物的繁殖力。因此，GnRHR基因在调节哺乳动物生殖发育和机能中起着关键作用，是繁殖性状的一个重要生理候选基因。国外研究证实，绵羊的GnRHR基因位于6号染色体上，由3个外显子和2个内含子组成。研究表明，GnRHR基因的多态性引起的氨基酸序列的改变会影响配体GnRH和受体GnRHR的结合力,进而影响动物的发育和生殖能力。 

目前，国内外对于绵羊GnRHR基因外显子2的多态性研究较少。刘忠慧等对小尾寒羊和多塞特羊2个绵羊品种中GnRHR基因的外显子1和2进行了多态性检测，结果发现，GnRHR基因外显子2区域发生了突变G230C，该突变导致了甘氨酸改变为半胱氨酸。但该研究未对多态基因型和产羔数进行关联分析，无法判断GnRHR基因是否是影响小尾寒羊和多塞特羊繁殖力的主效基因。孙洁等对小尾寒羊和湖羊、南非肉用美利奴、考力代和中国美利奴绵羊中GnRHR基因的外显子1-3进行了多态性检测，结果表明，在小尾寒羊和湖羊中GnRHR基因外显子2存在2个突变（A50G和A101），均引起氨基酸改变，突变纯合型（DD）小尾寒羊平均产羔数比野生型（CC）多0.81只(P<0.01)。 

PCR-SSCP是以PCR为基础，基于DNA构象差别而进行快速、灵敏、有效检测基因点突变，检测基因多态性的常用方法。其基本原理是经PCR扩增的DNA片段在变性剂或低离子浓度下，经高温处理使之解链并保持在单链状态下，DNA单链可折叠成一定空间构象，在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，相同长度DNA单链因其碱基序列不同，甚至单个碱基不同，导致形成的构象不同，而且单链DNA构象的变化很可能引起了迁移率的改变，每条单链处于一定 的位置，靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时，就会出现泳动变位，通过显色或显影后在凝胶上就会显示出带型的差别，即多态性。 

本发明选取GnRHR基因作为绵羊繁殖力的候选基因，利用分子生物学技术PCR-SSCP，检测策勒黑羊、吐鲁番黑羊品种中GnRHR基因外显子2的遗传多态性，分析研究其碱基突变对于绵羊繁殖性状的影响，进而用于绵羊繁殖力的早期选育，这对于提高农牧民经济收入、加快新疆肉羊业的发展具有重要意义和实践应用价值。 

发明内容

本发明的目的在于：提供利用PCR-SSCP技术检测，找出可显著影响绵羊繁殖力的分子标记，同时提供一种高效用于选育提高策勒黑羊和吐鲁番黑羊繁殖力的方法。 

本发明的目的是这样实现的：一种利用GnRHR基因检测绵羊繁殖力的方法，分步骤实施; 

提取策勒黑羊和吐鲁番黑羊基因组DNA，设计合成引物一对：上游引物F为5'-CCTACAGTTATACATCTTTGGGA-3'，下游引物R为5'-TGAGAAATACATACTGTGGGGAT-3'，其扩增片段大小为241bp，最适退火温度为53.8℃；PCR扩增反应体系：总体积为20μl，其中PCR Mixture10μl，ddH₂O8μl，上下游引物各0.5μl，DNA模板1μl；PCR扩增反应条件：94℃5min,30个循环的94℃30s、53.8℃30s、72℃1min，72℃5min，4℃保存；