[发明专利]一种层层自组装的microRNA纳米载体的制备方法及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于纳米材料生物学领域。本发明涉及一种基于静电吸引力的层层自组装技术，是以纳米金刚石作为基底材料，以生物安全性良好的鱼精蛋白硫酸盐和具有肿瘤靶向功能的小分子叶酸为自组装材料，构建出具有叶酸受体靶向功能的microRNA纳米载体。本发明制备的microRNA纳米载体具有自组装形成，microRNA保护能力较强，细胞靶向能力较强，基因沉默效率较高等特点。

背景技术：

RNA干扰（RNAi）是一种存在于植物和哺乳动物细胞中的基因沉默的自然机制。microRNA就是人们近年来刚刚发现的一类内源的具有RNA干扰活性的小RNA。这样的小RNA被通称为小干扰RNA。将大小在21-25bp左右的外源双链RNA（double strand RNA，dsRNA）导入细胞即可被加工成为单链的小干扰RNA（micro interfering RNA，以下简称miRNA），与单链miRNA互补的mRNA即可被降解并抑制其翻译表达即导致基因沉默。RNAi具有较好的特异性，RNAi技术的应用将为人类疾病的基因治疗开辟一个革命性的领域，对生命科学的影响将不亚于PCR技术。目前有3种方法可以触发RNA干扰：在靶细胞中引入可转录产生干扰RNA的DNA质粒；引入干扰RNA前体分子；在靶细胞中引入合成的小分子干扰RNA(miRNA)。其中，第三种方法因合成miRNA的化学反应步骤比较简单、非特异性不良反应小而引起了广泛关注。

miRNA不稳定，易被酶降解，难以被细胞吞噬，高效的转染载体对于其应用的发挥至关重要。目前利用重组病毒作为miRNA体内传递载体虽然传递效率高，但是潜在的生物安全性问题限制了其应用。非病毒型miRNA载体通常包括阳离子脂质体和阳离子聚合物两大类，阳离子脂质体转染效率高，但是其生物相容性差、细胞毒性大。阳离子聚合物虽然对质粒转染效率较高，但是对于小分子量的miRNA，其转染能力较弱，而且肿瘤组织靶向性较差。因此选择合适的miRNA传递载体，制备安全、稳定、高效且具有肿瘤靶向性的载体/miRNA复合粒子具有重要意义。

miR-34a被发现在乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞中低表达，而提高miR-34a在MDA-MB-231细胞中的表达量能够抑制MDA-MB-231细胞中Fra-1基因的表达，从而抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力（Yang,S.,Li,Y.,Gao,J.,Zhang,T.,Li,S.,Luo,A.,...&Liu,Z.(2012).MicroRNA-34suppresses breast cancer invasion and metastasis by directly targeting Fra-1.Oncogene.）。

纳米金刚石是一种碳纳米材料，生物相容性好，细胞毒性小，它与PEI等高分子相互作用，被用作基因载体。我们使用纳米金刚石与鱼精蛋白硫酸盐相互作用形成的纳米颗粒作为siRNA载体（专利公开号：103060379A），但是迄今为止，并未见使用该种颗粒吸附miRNA并具有癌细胞靶向效果的报道。

叶酸是维生素B复合体之一，它能够特异性的与叶酸受体结合，其平衡解离常数可以达到10^-9mol/L，是单克隆抗体与肿瘤细胞表面受体的亲和力的100多倍。癌组织细胞表面存在着相对正常组织细胞高表达的叶酸受体，这种特性使得叶酸受体可以成为肿瘤靶向治疗的通路，使用叶酸做为给药系统的靶向分子可以使得药物富集在肿瘤组织细胞中。

发明内容：

本发明的目的是提供一种以纳米金刚石为基底材料，通过静电吸引力的层层自组装技术构建出具有靶向功能，能较好的保护miRNA的纳米载体。以纳米金刚石和鱼精蛋白硫酸盐相互作用形成的纳米颗粒作为miRNA传递载体，并在形成的miRNA-鱼精蛋白-纳米金刚石纳米颗粒的外层再吸附上鱼精蛋白硫酸盐，最后将具有靶向功能的小分子叶酸吸附于纳米材料的最外层。该载体具有快捷的制备过程，RNA保护效果较好，癌细胞靶向效果较好，基因沉默效果良好的特点。

本发明提供一种具有乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞靶向作用的miRNA输送载体，其活性成分为纳米金刚石与鱼精蛋白硫酸盐通过极性相互作用形成基本骨架，在鱼精蛋白硫酸盐的外层通过极性作用吸附上miRNA，然后依次在miRNA的外层吸附上鱼精蛋白硫酸盐和叶酸。

一种层层自组装的microRNA纳米载体的制备方法，其特征在于，