[发明专利]一种检测血管内皮生长因子C在真核细胞CHO 中的表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生化的检测方法，具体来说，一种检测血管内皮生长因子C在真核细胞CHO 中的表达方法。

背景技术

血管内皮生长因子C(VEGF -C)属VEGF/PDGF 家族成员, 其受体为VEGFR -2 , VEGFR -3 。VEGF 通过VEGFR -2 调节血管和淋巴管的增生, 而VEGFR-3 表达则局限于淋巴管内皮,VEGF -C 为VEGFR-2 的结合, 产生生物学效应的所需浓度远高于VEGFR -C , 因此,VEGFR -3 是淋巴管增生特异性调节因子, 用VEGF -C 转基因鼠实验证实, VEGF -C 的高表达可以选择性地引起淋巴管增生[ 2] , 经研究,VEGF -C 表达与肿瘤淋巴管增生和转移的关系是VEGF -C 高表达可促进肿瘤的淋巴转移, 其机理是VEGF -C 促进了肿瘤周围及间质的淋巴管生长以及肿瘤组织中淋巴管增生。为进一步研究VEGF -C 在淋巴管增生中的作用及其机制, 我们构建了携带人VEGF -C cDNA 的基因片段的真核表达载体, 研究了它在真核细胞内的表达, 为探讨VEGF -C 与淋巴管增生的关系,VEGF -C 基因用于治疗淋巴水肿和某些癌肿的可行性提供实验依据。

发明内容

为克服上述技术问题，我们提出了以下技术方案：

一种检测血管内皮生长因子C在真核细胞CHO 中的表达方法，根据人VEGF -C cDNA 的序列, 设计合成一对特异性引物, 用RT -PCR 法克隆乳腺癌细胞MCF - 7VEGF -C 基因的cDNA , 回收PCR 产物连接于克隆载体。

本发明中，在所述步骤之后要扩增, 质粒提取, 酶切鉴定并进行基因序列鉴定；酶切回收VEGF -C cDNA 全长的基因片段, 与真核表达载体pcDNA3 .1(-)连接称重组质粒进行酶切鉴定；采用脂质体转染法将构建的pcDNA3 .1(-)/VEGF -C 转染至CHO 细胞中,G418 加压筛选培养；最后用Western -blotting 法检测细胞培养上清以及裂解细胞中的VEGF -C 蛋白。 

本发明的有益效果是，基因测序能够证实RT -PCR 产物包含VEGF -C cDNA 全长。重组pcDNA3 .1(-)中含有VEGF -C cDNA 全长序列,Western -blotting 检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF -C 蛋白存在。结论:成功构建了人类VEGF -C 真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。

具体实施方式

根据人VEGF -C cDNA 的序列, 设计合成一对特异性引物, 用RT -PCR 法克隆乳腺癌细胞MCF - 7VEGF -C 基因的cDNA , 回收PCR 产物连接于克隆载体。扩增, 质粒提取, 酶切鉴定并进行基因序列鉴定。酶切回收VEGF -C cDNA 全长的基因片段, 与真核表达载体pcDNA3 .1(-)连接称重组质粒进行酶切鉴定。采用脂质体转染法将构建的pcDNA3 .1(-)/VEGF -C 转染至CHO 细胞中,G418 加压筛选培养。最后用Western -blotting 法检测细胞培养上清以及裂解细胞中的VEGF -C 蛋白。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。