[发明专利]一种对胃癌细胞系MGC803和BGC823中TIMP3的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生化的检测方法，具体来说，是指一种对胃癌细胞系MGC803和BGC823中TIMP3的检测方法。 

背景技术

DNA甲基化（DNA methylation）是最重要的表观遗传学修饰方式之一，与肿瘤发生密切相关。抑癌基因启动区甲基化可以阻碍转录因子与启动子结合，导致基因转录失活，合成成熟功能蛋白受阻进而导致细胞增殖失控。有关抑癌基因甲基化失活的研究在临床肿瘤早期诊断，治疗以及预后判断方面具有重要指导意义，是目前的一个研究热点。 

我们前期曾对辽南高发区胃癌的多位点甲基化情况进行了检测，结果发现此地区胃癌患者P16、hMLH1、TIMP3、DKK3、RASSF1A以及CDH1等特定基因启动子区DNA甲基化频率和程度都明显增高[1]，但同时我们发现基因启动子区异常高甲基化与基因表达沉默并非完全相关，国外也有越来越多的研究者发现并提出了这个问题。 

发明内容

为克服上述技术问题，我们提出了以下技术方案： 

一种对胃癌细胞系MGC803和BGC823中TIMP3的检测方法，其特征在于，首先对待测抑癌基因进行生物信息学分析，针对性选择其转录区SNP位点，然后针对SNP多态性设计特异性上/下游引物，随后甲基化敏感限制性内切酶HpaⅡ酶切（MspⅠ作对照），最后对杂合子DNA进行MSRE-PCR检测，鉴定等位基因特定位点差异性甲基化。

本发明中，所述的SNP必须位于转录区。 

本发明中，每个待测抑癌基因至少选择4个候选SNP位点；最小等位基因频率不低于5%。 

本发明的有益效果是，可以有效阻碍转录因子与启动子结合，导致转录失活，合成成熟功能蛋白受阻而导致细胞增殖失控。 

附图说明

图1为MGC803 BGC823在rs191293675_ A/G位点上扩增出产物； 

图2为MGC803 BGC823在rs191293675_ A/G位点，A等位基因发生甲基化，而G等位基因并未甲基化。

具体实施方式

首先对待测抑癌基因进行生物信息学分析，针对性选择其转录区SNP位点，然后针对SNP多态性设计特异性上/下游引物，随后甲基化敏感限制性内切酶HpaⅡ酶切（MspⅠ作对照），最后对杂合子DNA进行MSRE-PCR检测，鉴定等位基因特定位点差异性甲基化；所述的SNP必须位于转录区；每个待测抑癌基因至少选择4个候选SNP位点；最小等位基因频率不低于5%。 

我们对两个胃癌细胞系（MGC803和 BGC823）进行了检测，实验结果证实了等位基因特异性甲基化（Allele- specific methylation, ASM）的存在，并且这种特异性甲基化与双等位基因差异性表达（Allele-specific expression；ASE）紧密相关。鉴定标准与鉴定结果如下所示：MGC803 BGC823在rs191293675_ A/G位点上均为杂合子。 

如图1：检测目的：筛选杂合子； 

          鉴定标准：A/G等位基因特异性引物均可以扩增出产物。

如图2：鉴定结果：MGC803和 BGC823均为A等位基因发生甲基化，而G等位基因并未甲基化。这种等位基因甲基化状态的差异被称为等位基因特异性甲基化（Allele- specific methylation, ASM）。 

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。