[发明专利]一种高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体地，本发明涉及一种高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

果胶是一类带负电荷的高分子多糖,由不同酯化度的D-(+)--半乳糖醛酸以ɑ-1,4糖苷键连接而成的多糖链,常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等组成的侧链,分子量介于25～360kDa之间(Jayani et al.,2005)。它广泛存在于高等植物，特别是水果和蔬菜的组织中，是果蔬植物细胞中胶层（胞间层）的主要成分。

内切多聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）属于糖苷水解酶第28家族（GH28），作用于果胶酸时能随机地从多聚半乳糖醛酸链内部消解α-1,4-糖苷键，产生聚合度为10～14的寡聚半乳糖醛酸。它是一种降解果胶的重要工业用酶，主要应用在食品工业中的果蔬汁生产加工领域。果蔬汁的混浊和粘度大等问题主要是由果胶质引起的，在果蔬汁的提取和澄清过程通过酸性果胶酶处理可提高果蔬汁的出汁率和澄清度(Nakkeeran et al.,2011;Rehman et al.,2013)。

我国果蔬汁生产规模逐年扩大，目前在商品化的果胶酶主要有黑曲霉等真菌来源的复合果胶酶酶系，也有单一的果胶水解酶、果胶裂解酶和果胶酯酶酶种。从质量上看，现有果胶酶还普遍存在酶活力不高，稳定性较差的问题。高比活、高催化效率的多聚半乳糖醛酸酶工程菌株的获得主要通过诱变、筛选和酶分子改良获得。诱变分为自然突变和人工诱变，自然突变成功的几率非常小，人工诱变的工作量较大且有益突变频率仍然较低，变异的方向和性质难以控制。筛选的盲目性较大，不容易获得目的菌株。酶分子改良目的性强，针对酶分子具体结构分析进行改造，从而达到提高比活力和催化效率的目的。

发明内容

本发明的目的是提供了一种高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体。

本发明的再一目的是提供编码上述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明以来源于Penicillium sp.的酸性多聚半乳糖醛酸酶为母本，采用分子生物学技术对酸性多聚半乳糖醛酸酶序列进行区域替换后表达。

根据本发明的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体，是多聚半乳糖醛酸酶的催化活性通道loop区域替换后得到的突变体，即多聚半乳糖醛酸酶的loop区域氨基酸序列由“RNGDKGSL”突变为“SAGDSQG”

所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SPAAEPAEGNRLIPRGSACTYSGVNGAAAAIAGKAGCSSITLNNVAVPAGTTLDLTGLAAGTKVIFEGTTTFGHKQWVGPLISISGTNIAVSGAAGHVIDGQGARWWDGKGSNTKTNIKPKFFLAHNLKGASTITGLNIKDTPVQVFSIDSSSGLTISGVTIDNSAGDSQGGHNTDGFDIGDSDHITITGATVYNQDDCLAINSGTNIIFSGGYCSGGHGLSIGSVGGRSNNVVDTVHISSTQVVNSQNGVRVKAVAGATGSIKGVTYQDITLSGITSQGVTIRQDYTNSGYTGNPTTQVPITGLTLNNVHGTVTSSGTDITVECGSAASCSGWTWTKVAVSGGKADLCKNAPANTC

所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。