[发明专利]一种血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质分析检测领域，特别涉及一种利用表面增强拉曼光谱（SERS）检测血浆中低丰度蛋白的方法。

背景技术

拉曼光谱是一种分子振动光谱，是对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。拉曼光谱分析过程操作简单快速，灵敏度高，是一种无损检测，但是拉曼光谱信号微弱，易受自体荧光干扰，因此利用拉曼光谱技术直接进行检测存在一定局限性。表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy，简称SERS)技术是一种常用的拉曼信号增强方法，当分子吸附于某些粗糙金属(如Au、Ag、Cu和Pt等)表面时，将产生局部电场增强或者电荷转移，使得这些分子的拉曼散射强度增加10⁴～10¹⁴倍，这就是SERS效应。SERS技术能淬灭生物分子荧光，获得的信号理想，检测所需功率较低，对生物组织样品损伤小，灵敏度高，可实现单分子检测。

人体血浆蛋白含有来源于几乎所有细胞、组织、器官的蛋白，然而，血浆蛋白的丰度差异巨大，血浆中21种主要高丰度及中等丰度的蛋白，如白蛋白、IgG、α1抗胰蛋白酶、α2巨球蛋白、转铁蛋白等占血浆总蛋白含量的99%以上，而其余的1%则由为数众多的低丰度甚至极低丰度的蛋白质组成。人体组织器官发生病变时，来自病变组织或细胞的蛋白会进入到血液系统，这些蛋白质与机体的病理、生理状况密切相关，因此，对这些蛋白质进行检测和分析是发现与各种疾病相关生物标志物的最有价值样本之一，这些蛋白质大部分都是低丰度蛋白，然而，低丰度蛋白难于检测，如何有效地检测和分析低丰度蛋白一直是分析科学领域具有挑战性的难题。难点主要在两个方面，一是低丰度蛋白的含量低于分析仪器的检测极限；另一方面，血浆蛋白中高、低丰度蛋白含量的差异巨大，往往可达10¹²之巨，低丰度蛋白的信号易被高丰度蛋白所掩盖。

目前对低丰度蛋白的检测方法主要有以下两种：第一种方法是先通过二维凝胶电泳分离高、低丰度蛋白，再将分离得到的低丰度蛋白酶解后用质谱进行检测分析；第二种方法是将高、低丰度蛋白先混合酶解后，色谱分离蛋白质酶解后的肽段，最后对肽段进行质谱检测分析。上述方法都存在所需样品量大，耗材昂贵，步骤繁复，耗时较长等问题。另外质谱分析易受洗脱液等因素的干扰，无法鉴定区分等质量蛋白质，而且质谱仪价格昂贵，难于广泛推广。

发明内容

本发明目的在于提出一种利用SERS技术检测血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的方法。本方法采用疏水性聚合物去除血浆中的高丰度蛋白后，利用印迹固定化基质富集低丰度蛋白，利用SERS技术检测获取血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱，建立多种癌症血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱数据库，经多变量统计分析进行聚类分析，获得健康人与癌症患者的血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱对应的判别散点分布图，据此实现不同癌症的判别。本发明具有快速、操作简单、成本低廉等特点，可有效地检测到血浆中低丰度蛋白的表面增强拉曼光谱，从而克服了现有技术中的不足。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

（1）去除血浆高丰度蛋白

取疏水性聚合物于套有离心柱的收集管中，加入洗脱液，充分混匀，3000～6000rpm离心1～5min后，将收集管中的液体倒掉，重复三次得到经洗脱液洗脱的疏水性聚合物。取血浆标准样品，加入1～10倍体积量的洗脱液进行稀释，加入到含有经洗脱液洗脱的疏水性聚合物的离心柱中，利用移液器反复抽吸充分混匀，置于摇床中200～350rpm震荡10～15min，2000～5000rpm离心，去除沉淀物，收集上层的低丰度蛋白溶液。

（2）富集血浆低丰度蛋白

取印迹固定化基质，按照印迹固定化基质︰血浆标准样品为（1～2）g︰（10～20）μl的比例，与步骤（1）收集到的低丰度蛋白溶液混合，孵育8～15min，然后将印迹固定化基质转入漂洗液中浸泡10～20min，取出在室温下吹干备用。

（3）低丰度蛋白SERS增强基质混合液的制备

将步骤（2）吹干的印迹固定化基质剪碎并收集于离心管中，加入冰醋酸进行溶解，充分搅拌直至完全呈现为透明胶体状态时，加入SERS活性金属纳米粒子，充分搅拌，水浴42～65℃孵育15～30min，静置分层，直至固相杂质析出，制成低丰度蛋白SERS增强基质混合液。

（4）血浆低丰度蛋白SERS光谱检测

取低丰度蛋白SERS增强基质混合液2～20μl进行SERS检测。