[发明专利]快速检测猪嵴病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及发明一种快速检测猪嵴病毒的SYBR Gree  实时荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒可高效方便地对临床样本中猪嵴病毒进行检测及定量，可以用于猪嵴病毒病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。 

背景技术

猪嵴病毒（Porcine kobuvirus,PKoV）是一种无囊膜正链RNA病毒，属小RNA病毒科，嵴病毒属。自2007年，猪嵴病毒在匈牙利被首次检测到后，很快在中国大陆、亚洲其他国家（包括泰国、日本、韩国）、南美的巴西及欧洲荷兰等国被发现，而且感染率均较高，从16.7%到 99.0%不等。研究数据表明在具有腹泻症状的猪群中，阳性率明显高于无腹泻症状的猪群，可能暗示其对猪具有一定的致病性。 

尽管如此，猪嵴病毒是否与肠道疾病有关，现在尚无定论，关于致病机制方面的研究成果也未见报道。但是在猪粪样品中检出率较高，长期处于隐性感染状态，可能对宿主产生不利影响。相关报道指出，在对仔腹泻猪粪便样品的病原分子检测中，常引起腹泻的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒均为阴性， 少数轮状病毒为阳性，而猪嵴病毒的阳性率最高，因此，推测该病毒可能与仔猪腹泻有关。 

鉴于此，研发一种快速检测猪嵴病毒感染的荧光定量PCR试剂盒，可高效方便地对临床样本中猪嵴病毒进行检测及定量，可用于猪嵴病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。 

国内学者徐志文、赵勤等发明了一种检测猪嵴病毒的RT-PCR试剂盒，RT-PCR用于病毒病的诊断虽然具有灵敏度高、快速、特异的特点。但是存在无法对检测样品进行准确定量、检测通量不高，并且电泳等PCR后的处理过程容易造成污染而出现假阳性，限制了该方法的应用。 

荧光定量PCR技术作为PCR技术的发展，以其独特的优势广泛应用于众多领域的研究中。为了建立一种较为快速准确的检测猪嵴病毒的检测方法，本研究选择了SYBR Green I  荧光染料法。与TaqMan探针法相比较，SYBR Green I  荧光染料法操作简便，成本更为廉价。通过优化实时荧光定量PCR反应体系参数，我们发明了一种用于猪嵴病毒检测的SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒。该方法引入了特异性扩增引物以及SYBR Green Buffer体系，使得检测的灵敏度和特异性得到了很大程度的增强，并避免了漏检和误检，该试剂盒能够达到快速准确检测的目的。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猪嵴病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪。该检测方法相对于传统的检测方法具有灵敏度高、效率高的优点。 

本发明试剂盒可以应用于（抗）猪嵴病毒药物的研究，可对生物制品进行定量检测及质量监控，可用于猪嵴病毒引起的流行病学的调查。总之，该试剂盒能够为相关的基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。 

为了达到以上目的，本发明采取以下技术方案： 

试剂盒的组成及使用方法：

1.试剂盒的组成

a)RNA裂解液，b) PrimeScript? RT Enzyme Mix I，c)逆转录反应液，d)定量引物F及R e) SYBR? Premix Ex Taq II，f) ROX Reference Dye,g)标准阳性模板，h)阴性对照品i)无菌双蒸水

所述逆转录反应液含有5×PrimeScript? Buffer， Oligo dT Primer，Random 6 mers引物。

荧光定量引物F及R，分别为（SEQ IDNO 1）和（SEQ IDNO 2）所示的核苷酸序列。 

标准阳性模板是含有猪嵴病毒特异性目的片段的质粒，该质粒转化到大肠杆菌DH5a增殖后用碱裂解法提取，经过DNA纯化试剂盒纯化，分光光度计吸光值A260下定量，-20℃保存。 

阴性对照样品由SPF猪粪便样品中提取RNA，经过逆转录获得的cDNA样品。 

SYBR? Premix Ex Taq II液含有TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR? Green I，购自大连宝生物公司。