[发明专利]改进的聚合血红蛋白制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种聚合血红蛋白制备方法，特别是用于制备平均分子量较低、分子量分布较窄且有效转化率较高的聚合血红蛋白的方法。

背景技术

由于无基质血红蛋白不能直接应用于人体，因此血红蛋白类载氧体（HBOCs）已经成为目前国际血液代用品研究领域的主流方向。近几十年来，人们主要通过对血红蛋白进行聚合和五磷酸吡哆醛（PLP）修饰等方式来提高HBOCs制品的安全性和延长其在体内的作用时间。经过几十年的研究，该项领域的技术已取得了突破，美国、加拿大等国的部分研究制品已完成了Ⅲ期临床试用。但是，随着HBOCs在实验动物或者临床中应用考察，也出现了不同程度的问题，如平均动脉压升高、血管阻力上升、微循环血流量减小、组织血氧不足和免疫原性增大等不良反应。引起此类血管性疾病和免疫方面问题的原因很多，分子量过大是其中的原因之一。

美国FDA在对Biopure公司聚合牛血红蛋白Ⅲ期临床实验的批文中明确要求要降低制品的平均分子量。因此，尽管目前对HBOCs制品的最佳分子量还没有统一的公认标准，但适当降低HBOCs制品的分子量已经成为研究学者们的共识。这与血浆代用品如羟乙基淀粉制品分子量从早期的480kD(美国杜邦公司的HESSPan)逐渐下降至200kD(HES)和130KD(Voluven)，即从高分子量逐渐向中分子量发展的趋势相吻合。

戊二醛是一种广谱同型双功能交联剂，其分子结构中含有两个相同活性的醛基基团，可与血红蛋白分子中的氨基发生共价键合作用形成Schiff氏碱，在空间位置较为接近的两个含氨基的氨基酸残基之间搭桥，形成血红蛋白分子内和分子间的交联。由于血红蛋白分子中含有44个氨基，而且戊二醛中的醛基与血红蛋白分子中的氨基具有很高的反应活性，因而使得血红蛋白的交联聚合是一个非常复杂而快速的反应过程，并导致了目前此类反应存在一个技术难题是，如要求获得的产率高（即有效转化率高），则会使平均分子量过大，特别是超大分子产物的含量比例会增加，从而会导致制品保存不稳定，输用中也易于形成微血管流动不畅甚至栓塞。

为了制备分子量分布较均匀且平均分子量较小的HBOCs制品，US 4826811中提出了肾透析膜磷酸化和交联方法，US4001200提出了加入竞争型抑制剂且边加入交联剂边搅拌的交联方法，CN1420127A报道了凝胶柱上聚合方法等，其目的主要都是为使交联剂与血红蛋白能更好地均匀混合或接触。虽然这些方法都能取得一定的较好效果，但同时都存在制备周期长，步骤繁琐，成本高等不足。

发明内容

    针对上述情况，本发明提供了一种改进的聚合血红蛋白制备方法，特别是用于制备平均分子量较低、分子量分布较窄且有效转化率较高的聚合血红蛋白的方法，可以满意地解决上述问题。

    本发明改进的聚合血红蛋白制备方法，是以无基质人脱氧血红蛋白（即T态学血红蛋白）的重量/体积含量为4~14%的血红蛋白溶液为原料，在惰性气体环境和搅拌条件下，经钛棒滤芯将醛基型双功能交联剂送入原料溶液，在0℃~10℃进行聚合反应，制备得到平均分子量为100-210kD，优选分子量为110-170kD的聚合血红蛋白，原料溶液中的血红蛋白与醛基型双功能交联剂的摩尔比为4~8:1，优选为5~7:1。

聚合反应中所用的醛基型双功能交联剂，除优选常用的戊二醛为交联剂外，根据需要也可以使用如开环棉子糖、双阿司匹林等也具有高活性的二醛类交联剂。，交联剂的用量过大会更易于形成平均分子量较高的产物，但用量过低则会降低有效转化率。

    所说作为原料的血红蛋白溶液，优选采用以生理盐水与无基质人脱氧血红蛋白配制成的血红蛋白液体。此外，也可以由以超纯水或者PBS溶液等配置的血红蛋白液体作为原料。由于生理盐水可具有与血红蛋白在体内同样的离子浓度，有利于其功效的更好发挥，且廉价易得。

    上述方法中所说的无基质人脱氧血红蛋白，可以采用中国专利CN1333296A的方法制备得到的包括由人外周血红蛋白（包括过期的血红蛋白），人胎盘血血红蛋白，特别是由提取了干细胞后的人胎盘血等多种血液来源提取得到的相应血红蛋白。由于胎盘血的血红蛋白以HbF（α2γ2）为主，HbF氧亲和力高，可以携带更多的氧进入缺氧组织，而且胎盘血红细胞的含量高（比成人静脉血高出30~50%），可以分离到更多的血红蛋白，而免疫原性又远低于成人外周血。因此以人胎盘血红蛋白为原料提取的血红蛋白不仅更为理想，也是开发利用人胎盘血的一种有价值的途径。本发明上述制备方法的原料，优选该人胎盘血血红蛋白。