[发明专利]一种高山被孢霉重组基因表达系统及其构建方法和应用有效
| 申请号： | 201310524221.4 | 申请日： | 2013-10-30 |
| 公开（公告）号： | CN103571762A | 公开（公告）日： | 2014-02-12 |
| 发明（设计）人： | 陈永泉;陈卫;郝光飞;陈海琴;郝丹辉;赵山山;赵建新;顾震南;张灏 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N1/15 | 分类号： | C12N1/15;C12N15/80;C12P7/64;C12R1/645;C12R1/01 |
| 代理公司： | 北京君智知识产权代理事务所 11305 | 代理人： | 刘秀娟 |
| 地址： | 214122 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 高山 被孢霉 重组 基因 表达 系统 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种过量表达苹果酸酶基因的同源重组高山被孢霉菌株，其特征在于，该菌株是用含苹果酸酶基因的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。
2.根据权利要求1所述的一种过量表达苹果酸酶基因的同源重组高山被孢霉菌株，其特征在于，该菌株是用包含质粒pBIG2-ura5s-malE1或质粒pBIG2-ura5s-malE2的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。
3.根据权利要求1或2所述的一种过量表达苹果酸酶基因的同源重组高山被孢霉菌株，其特征在于，该菌株是用重组质粒pBIG2-ura5s-malE1或pBIG2-ura5s-malE2转化根癌土壤杆菌后，进一步用经转化的含质粒pBIG2-ura5s-malE1或pBIG2-ura5s-malE2的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的，其中的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是ura5基因中的213bp-230bp之间共18bp的序列缺失的Mortierella alpina ATCC32222菌株。
4.一种构建权利要求1或2所述的同源重组高山被孢霉菌株的方法，其具体步骤如下：
a)提取Mortierella alpina ATCC32222菌株的RNA，通过反转录获取cDNA,利用PCR扩增分别获取ura5基因、内含子DNA片段IT、苹果酸酶1基因malE1和苹果酸酶2基因malE2；
b)分别构建重组质粒pBIG2-ura5s-malE1和pBIG2-ura5s-malE2；
c)分别用构建获得的重组质粒pBIG2-ura5s-malE1或pBIG2-ura5s-malE2转化根癌土壤杆菌；
d)分别用经过转化的含质粒pBIG2-ura5s-malE1或pBIG2-ura5s-malE2的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株；
e)筛选鉴定转化菌株，获得过量表达苹果酸酶1或2基因的同源重组高山被孢霉菌株。
5.一种根据权利要求4所述的构建同源重组高山被孢霉菌株的方法，其特征在于步骤c）中所使用的根癌土壤杆菌为：Agrobacterium tumefaciens C58C1。
6.一种根据权利要求5所述的构建同源重组高山被孢霉菌株的方法，其特征在于步骤d）中所使用的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是ura5基因中的213bp-230bp之间共18bp的序列缺失的Mortierella alpina ATCC32222菌株。
7.一种根据权利要求6所述的构建同源重组高山被孢霉菌株的方法，其特征在于构建pBIG2-ura5s-malE1时，先利用ura5基因构建转化质粒pBIG2-ura5s，再利用转化质粒pBIG2-ura5s和苹果酸酶1基因malE1进一步构建重组质粒pBIG2-ura5s-malE1；构建pBIG2-ura5s-malE2时，先利用转化质粒pBIG2-ura5s和IT基因片段构建转化质粒高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-ITs，再利用转化质粒pBIG2-ura5s-ITs和苹果酸酶2基因malE2进一步构建重组质粒pBIG2-ura5s-malE2。
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