[发明专利]瓠瓜抗病毒病基因片段或基因标记及应用

说明书

技术领域

本发明是利用抗病基因同源序列法，克隆瓠瓜抗病毒病基因片段或者将其转化为分子标记等，主要涉及瓠瓜常规杂交育种，分子标记辅助育种，抗病毒病基因的定位和分子作图，抗病毒病基因的克隆以及抗病基因的调控机理分析等方面，属于植物生物技术科学领域。

背景技术

瓠瓜是长江中下游重要的蔬菜作物之一。病毒病是瓠瓜生产上最重要的病害。主要在定植初期发病，造成植株矮小，叶片皱缩，植株无法正常生长，严重时后期叶片枯黄或死亡。成株期发病，叶片上呈现深绿色和浅绿色斑驳，往往植株顶部连续几张新叶发病，造成植株生长缓慢。重病株上部叶片畸形皱缩，病株结瓜数减少，瓜面出现黑色小斑点且畸形，失去商品性。主要表现为：①花叶型：在新抽的幼叶上症状最为明显，老熟叶片症状不明显，主要表现为在新叶上出现黄绿相间的花叶症状，叶片成熟后变小、皱缩、边缘卷曲。在果实上表现为瓜条出现深浅绿色相间的花斑，染病后瓜条生长缓慢甚至停止，畸形。发病严重时，植株矮小，茎节间缩短，使植株萎蔫。②皱叶型：多出现在成株期，叶片出现皱缩，产生暗绿色斑驳隆起，边缘难于开展，同时叶片变厚、叶色变浓，引起植株矮化。③蕨叶型：黄瓜植株生长点新叶无法正常开展，而后变细皱缩成蕨叶状，叶缘向内卷曲，多变成鸡爪状，植株生长点受到严重抑制，达不到正常的生长高度。病毒病影响了瓠瓜植株的正常的生长发育过程，给生产带来极大的经济损失。抗病基因的利用及抗病育种是瓠瓜病害防治最有效的方法。

二十世纪四十年代，Flor提出了经典的“基因对基因”理论模型，即植物和病原菌体内各自存在一个显性基因，植物抗病基因或病菌无毒性(Avr)基因的缺失或改变都能引起病害的产生。这个模型适用于大多数活体营养型病原菌，包括病毒、细菌、真菌和线虫类。“基因对基因”抗病性一般是受体被作为模型：植物抗病蛋白能够直接或间接的识别源自病菌的Avr产物。一旦这种识别发生，就会引起防御反应。大多数抗病基因(Resistance gene；R)触发的抗性与快速防御反应相关，称为过敏性反应(hypersensitive response；HR)。而目前，大多数抗病基因的产物都含有蛋白识别的结构域，如富含亮氨酸的重复单位(LRR)的结构域或卷曲螺旋(CC)的结构域；信号转导结构域，如核苷酸结合部位(NBS)或蛋白激酶(PK)结构域。一些抗病基因产物被预测为细胞质蛋白，而另一些通过一个跨膜结构域(TM)贯穿细胞膜。这些结构域组合能够产生不同类型的R蛋白。根据结构的特性已经鉴定出至少六种不同类型的R基因：1)NBS-LRR，2)LRR-TM-PK，3)LRR-TM，4)CC-TM，5)PK，6)PK-PK。其中，NBS-LRR类抗病基因是植物体内存在的最大一类抗病基因；这些抗病基因在结构上的保守性为我们利用抗病基因同源序列法克隆其他作物的抗病基因带来了潜在可能。在已知分离获得的抗病基因中，小麦抗叶锈病基因Lr10和马铃薯抗马铃薯X病毒基因Rx2就是利用抗病基因同源序列法克隆抗病基因的经典例子，说明利用该法克隆抗病基因是可行的。

发明内容

技术问题

本发明的目的是利用抗病基因同源序列法快速鉴定瓠瓜病毒病基因片段或者将其转化为分子标记。结果一方面可用于瓠瓜抗病毒病分子标记辅助选择育种，另一方面也为抗病毒病基因的克隆提供参考依据。

技术方案

本发明前期对大量瓠瓜种质资源进行抗病性筛选，在获得1份高抗瓠瓜病毒病抗病种质的基础上，应用抗病基因同源序列法克隆抗病毒病基因片段，通过与已知抗病基因同源性及序列比对分析等方法确认；为开发相应的分子标记和利用cDNA末端快速扩增技术获得抗病基因的全长奠定基础。

为了实现上述目标，本发明采用抗病基因同源序列法对瓠瓜抗病毒病基因进行克隆，获得了抗病毒病基因片段或者基因标记3个，片段大小分别为510bp，510bp和504bp。以该基因片段序列为基础，开发相应的分子标记，可以进行瓠瓜抗病毒病分子标记辅助选择育种；同时利用基因片段或者基因标记进行新的种质资源的创新；结合已有的分子标记可以实现瓠瓜抗病毒病基因的分子作图；利用这些基因片段，通过设计基因特异引物，采用cDNA末端快速扩增技术分离瓠瓜抗病毒病基因，为通过基因工程改良瓠瓜的抗病性奠定基础；也为最终解析瓠瓜抗病毒病基因的分子机理提供了基因资源。

本发明的积极效果：

1)有利于快速开发与抗病基因紧密连锁的分子标记。通过鉴定的瓠瓜病毒病基因，开发相应的共分离功能性标记(SNP、SCAR等)，可以快速的用于抗病基因的分子标记辅助选择，准确性高。