[发明专利]一种检测基因突变的引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及检测低拷贝突变的技术领域，特别是一种检测基因突变的引物及应用。

背景技术

随着个性化医疗事业的发展，SNP基因分型分子诊断技术在药物基因组学的研究中发挥着越来越重要的作用，分子诊断技术或基因诊断技术己经逐步应用于临床的辅助诊断和用药。目前，我国在SNP、突变分子等诊断技术上的检测技术相对比较落后，随着国家十二五中长期发展纲要的逐步实施，特别是临床诊断技术发展规划的提出，将逐步促进我国临床诊断水平的快速发展。开发一种快速、准确的SNP检测方法，并将其应用于肿瘤的早期筛查、肿瘤靶向用药和预后、细菌和病毒的耐药性研究具有非常重要现实意义。

自20世纪80年代PCR技术问世，PCR技术被逐渐广泛地应用于分子诊断中，基于PCR技术的SNP检测技术也得到了迅速的发展，并不断衍生出诸如：PCR-RFLP，allele-sepecific PCR，TaqMan probe，ARMS，PNA-LNA clamp荧光PCR、Cycleave probe PCR，Nanofluidic Digital PCR Arrays，MassArray和DNA芯片等新的检测手段和技术。PCR-RFLP是早期实验开发检测SNP分型技术，它依赖于巧妙地选择限制性内切酶切出用于识别突变位点的短片段长度多态，但是这种方法需要电泳分离酶消化之后的产物，这将严重限制反应的通量和操作的自动化。ARMS技术与allele-sepecific PCR大致相同，利用Taq酶缺失3’～5’的外切活性，3’端错配的引物低于正常引物的延伸速度，当错配数目达到一定的严谨程度时，3’-端则无法延伸，如果PCR有条带，说明有相应的突变。ARMS技术敏感性和特异较高，已经成功应用于临床检测SNP，但是ARMS技术最低只可以检测到10个拷贝，很大程度上，限制了其广泛用于临床检测细菌和病毒的耐药、分型检测。TaqMan探针是一种寡核酸探针，在探针的3’末端连接有荧光报告基团，而5’末端连接有荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，当PCR扩增时，Taq酶的5’外切酶活性能将结合到靶DNA链上的探针的淬灭基团切除掉，使探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。通过使用不同的荧光报告基团，在同一个PCR中可以同时检测不同的酶切消化等位基因特异性探针。这种5’外切酶实验己经成功用来区分只有一个碱基差异的等位基因。尽管如此，Taqman探针技术同样遇到ARMS技术相同的开发瓶颈。

Cycleave probe PCR，技术原理类似Taqman探针，只是探针含有一个rNTP碱基于SNP互补，当存在突变时，rNTP与突变配对，RNaseH识别并切割rNTP，使探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，荧光产生，此项技术缺点是背景较高，探针容易降解，引物探针设计受限制。PNA-LNA-clamp技术，采用NestPCR技术和PNA-LNA-clamp探针，PNA-LNA-clamp探针特异性的封闭野生性SNP，阻止野性性模板扩增从而达到扩增突变的目的。虽然这项技术很灵敏，但经历两次PCR容易污染，探针设计也受到限制。上述检测技术采用普通的引物对靶序列进行扩增检测，尤其是多重PCR难以避免非特异性扩增。Jong-Yoon Chun等发明的DPO(Dual priming oligonucleotide system，美国专利号US 2013/0090464A1)提出在引物中插入5个黄嘌呤或次黄嘌呤且与靶序列有5个碱基对位，可以增加引物的特异性，抑制非特异性扩增，且具有SNP的检测能力。DPO主要为多重PCR设计，由于引物3’-端起第10个碱基位置插入5个次黄嘌呤的且与靶序列有5个碱基对位，虽然一定程度上抑制了非特异性扩增，DPO的敏感性和基因突变的检测能力并不明显。基于以上，开发出一种经济实用型、特异性高、敏感性强的基因突变检测方法是当前要研究的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：针对现有的检测目的基因突变技术存在敏感性弱、检测能力弱、特异性弱等问题，提供一种可检测出低拷贝的基因突变，并提供一个新的检测体系的检测基因突变的引物及其应用，从而可以高效、特异的扩增需要检测的目的基因突变。

本发明采用的技术方案是：一种检测基因突变的引物，该引物包括如下三部分：

1)锚定序列：该序列位于引物5’-端，与模板有大于14个碱基配对；