[发明专利]栽培黑麦籽粒Waxy蛋白亚基及其提取、鉴定方法和编码基因与应用

权利要求书

1.栽培黑麦的黑麦籽粒Waxy蛋白亚基，具有序列表1所示的氨基酸排列顺序。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因，其特征在于具有序列表2所示的核苷酸序列；或与序列表2所示的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

3.扩增权利要求2所述编码基因的引物对。

4.根据权利要求3所述的引物对，其特征在于表达引物的序列为WxexpF：5’-ATGAACCTCGTGTTCGTCGGC-3’，WxexpR：5’-TCAGGGAGCGGCGACG-3’。

5.权利要求1所述黑麦籽粒Waxy蛋白亚基在调节禾谷类籽粒直链淀粉合成酶与调节禾谷类籽粒直链淀粉含量的应用。

6.权利要求2所述编码基因的表达方法，其特征在于首先采用PCR方法扩增栽培黑麦Waxy基因完整编码序列，将所得扩增产物回收目的片段，与载体连接并转化大肠杆菌，在LB平板上37℃过夜培养，利用测序引物进行阳性筛选并测序；利用权利要求5的引物对扩增阳性质粒，将回收片段克隆至表达载体并转化，将所得阳性菌株诱导后离心收集菌体即得。

7.权利要求1所述黑麦籽粒Waxy蛋白亚基的提取分离方法，其特征在于采用多籽粒提取，去除悬浊液中的面筋和种皮，然后将粗淀粉加入上样缓冲液后高温水浴和沸煮，离心取上清液；将从籽粒中提取的Waxy蛋白粗提液加载到DuoFlow蛋白纯化系统，收集目标洗脱组分供质谱测序及SDS-PAGE检测。

8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于所述高温水浴条件为80℃、30min水浴。

9.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于所述Waxy蛋白粗提液采用DuoFlow UNO Q1阳离子交换柱，其中挂柱缓冲液为低浓度Tris-Hcl(20mM Tris-Hcl，pH9.5)，蛋白洗脱液为高浓度NaCl：20mM Tris+1M NaCl，pH9.5；在280、260、214或200nm波段进行检测。

10.权利要求1所述黑麦籽粒Waxy蛋白亚基的鉴定方法，其特征在于采用CE鉴定方法，以DuoFlow纯化产物为标准样，以0.05mM硼砂+15％乙腈+1％SDS溶液(pH9.5)为缓冲液，采用分离电压20kV，温度25℃，检测波长214nm，压力进样，0.5psi×5s。