[发明专利]一种能专门识别重组猪干扰素ɑ的单克隆抗体及ELISA试剂盒制备方法

说明书

技术领域

本发明主要涉及一种针对重组猪干扰素ɑ蛋白的单克隆抗体和用于检测重组猪干扰素ɑ产品的ELISA试剂盒。

背景技术

猪干扰素为一种广谱的抗病毒制剂，主要是通过与细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，进而抑制猪瘟、口蹄疫等病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。猪干扰素在畜牧业生产上的应用已受到高度关注。最早在国内应用于兽医临床的是猪白细胞干扰素，由于这种干扰素存在工艺成本高等问题。而基因工程技术的发展为猪干扰素大量生产提供了新的平台。我室采用基因工程技术获得了一种重组猪干扰素ɑ（重组猪α干扰素的制备方法，专利号2008100201804），临床试用结果表明其可有效治疗猪病毒性腹泻等疾病。但目前市场上尚无重组猪干扰素ɑ产品的检测试剂盒，阻碍了其广泛应用，因此有必要研制重组猪干扰素ɑ相应检测试剂盒，确立检测方法，供实验室和市场上对重组猪干扰素ɑ产品的鉴定和验证用。

发明内容

本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种重组猪干扰素ɑ蛋白的单克隆抗体及ELISA试剂盒制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种能专门识别重组猪干扰素ɑ的单克隆抗体，包括以下步骤：

（1）将纯化的重组猪干扰素ɑ蛋白免疫Balb/c小鼠，分4次免疫，以间接ELISA检测小鼠血清中重组猪干扰素ɑ抗体的效价，效价高者选为下一步细胞融合的对象；

（2）取经最后强化免疫的Balb/c小鼠，收集血清，消毒。无菌取出小鼠脾脏、分离脾细胞，与新鲜制备、生长良好的小鼠骨髓瘤细胞融合，HAT培养基稀释融合细胞悬液，加入已预先铺有饲养细胞的96孔板中，100μl/孔，于培养箱中培养，筛选单克隆抗体杂交瘤细胞，共筛选得2株杂交瘤细胞，编号为B1和D6；

（3）取D6、B1杂交瘤细胞培养上清，采用SIGMA公司单克隆抗体亚型检测试剂盒检测，编号为D6和B1抗重组猪干扰素ɑ杂交瘤细胞株株所分泌抗体的亚型分别为IgG1和IgG2a；

（4）腹腔内注射液体石蜡，6～8d后每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞悬液；7～10d后观察小鼠腹部膨胀程度收集腹水，经离心去沉淀后以辛酸-饱和硫酸铵粗纯，再以DEAE阴离子交换层析纯化单抗，-80℃保存。

一种ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求书1的单克隆抗体制备得到抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体包被酶标反应板和酶标记物、标本稀释液、洗涤液、底物液、阴性质控品、阳性质控品和终止液；

所述的标本稀释液为：含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）；

所述的洗涤液为：含有0.05％Tween20的0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBST）；

所述的底物液为：TMB-H₂O₂尿素溶液；

所述的终止液为：2mol/L H₂SO₄溶液；

所述的阴性质控品为：0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）；

所述的阳性质控品为：1mg/ml重组猪干扰素ɑ蛋白；

所述的酶标记物的制备包括以下步骤：

取编号为B1抗重组猪干扰素ɑ杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，采用过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶的酶标记物，以饱和硫酸铵沉淀法进行纯化。纯化检测后，加入终浓度为50%的甘油、0.1%的硫柳汞置-20℃保存；

所述的抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体包被酶标反应板的制备包括以下步骤：

取96孔酶标板一块，包被编号为D6的抗重组猪干扰素ɑ杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体100ng/孔，4℃过夜，取包被板加200μl PBS稀释的10％小牛血清37℃封闭1.5小时，得到抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体包被酶标反应板；

所述的ELISA检测试剂盒，所述的检测重组猪干扰素ɑ含量的临界值为50ng/ml。

本发明的优点：

建立了一种快速、准确，利用高通量检测重组猪干扰素ɑ产品的检测方法，为兽药管理部门提供一套实用有效的试剂盒产品。

说明书附图：

图1为抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体杂交瘤细胞染色体计数（×1000）；

图2为Western-blot检测抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体特异性；其中