[发明专利]一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法

权利要求书

1.一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）种子菌培养：将---18~-20℃保存的工作种子菌的菌种接种种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速215~220r/min，培养温度36~38℃，初始pH值6.8~7.2，培养时间9.5~10h；

（2）发酵：将培养好的种子液按接种量1-2%接入发酵罐进行发酵，发酵培养基量为18~22L，即向发酵罐中通入无菌空气，通气量为1.4~1.6L/min，保持发酵罐内的含氧量在10~20%，设定培养温度37℃，机械搅拌转速为210~230r/min，加入2~4mol/L的氨水，控制发酵pH在7.0~7.1；

（3）补料：发酵2~3h，紫外分光光度仪测定OD₆₀₀为0.4~1.0后，每隔一小时添加蛋白胨20~100g，酵母粉10~40g，葡萄糖5~20g，（NH₄）₂SO₄ 1~5g，添加2~4次；

（4）诱导：补料2~3h后，紫外分光光度仪测定OD₆₀₀为1.0时，一次性添加浓度为50~100g/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)补料液5~40ml，蛋白胨10~50g，酵母粉10~50g，甘油20~100ml，（NH₄）₂SO₄  2~10g，然后将温度调至32℃进行目的蛋白的诱导表达4~6h；

（5）革兰染色及菌体湿重的测定：诱导表达4~6h后，发酵结束，收集菌液，经革兰染色初步检测菌体形态，并在转速为7000r/min，温度为4℃的条件下离心12~16min后，取菌体沉淀物，测定菌体湿重，范围应在0.0200~0.0250g/ml；

（6）第一次离心：在转速为7000r/min，温度为4℃的条件下离心13~16min后留取菌体沉淀；

（7）重悬沉淀的菌体：重悬时每100g湿重菌体加1L的1×PBS（NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄ 2.9g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L）；

（8）破碎菌体：用机械破碎的方法，破碎时用800 bar的压力连续对菌体冲撞3~4遍，经革兰氏染色，检测破菌率达到95%以上；

（9）第二次离心：在转速为12000r/min，温度为4℃的条件下离心14~16min后取上清液；

（10）超滤浓缩：将第二次离心得到的上清液使用0.22μm孔径的膜包进行超滤收集通过膜包的下游液体，再用30kD孔径的膜包进行10倍浓缩，收集未通过膜包的上游液体，即为rPoIFNα1的粗制品。

2.根据权利要求1所述的一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法方法，其特征在于所述种子培养基的组成为：工业级蛋白胨1~10g/L，工业级酵母粉1~5g/L，NaCl1~10g/L，pH5.1~7.1。

3.根据权利要求1所述的重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法方法，其特征在于所述发酵培养基的组成为：工业级蛋白胨1~10g/L，工业级酵母粉1~5g/L，葡萄糖0.1~1g/L，NaCl 1~10g/L，甘油0.1~3.33ml/L,消泡剂0.01~0.33ml/L。