[发明专利]一种以重楼芽轴为外植体的胚状体诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重楼植物的组织培养方法，特别是涉及一种以重楼芽轴为外植体的胚状体诱导方法。

背景技术

中国药典规定的中药重楼为滇重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis)和华重楼(Paris polyphylla var.chinensis)的地下茎，前者主产于云南，后者主产于四川。《神农本草经》最早记载的蚤休即华重楼。重楼具有清热解毒、消炎止痛、活血化淤、凉肝定惊的功效。

近年来因发现重楼具有抗病毒、抗肿瘤作用而需求量大增。重楼中药材历来以野生资源提供药用，近年来由于对野生资源的过度采挖，致使野生重楼资源遭到了毁灭性的破坏，现己濒临灭绝，因而大力开发重楼植物资源具有十分重要的意义。

目前制约重楼植物规模化栽种的主要问题是重楼种苗的短缺。重楼种子由于存在种胚发育不完全，胚乳坚硬，胚轴后熟等明显“双重休眠”特性，因此播种后通常需要经历两冬一夏才能萌发成苗，是典型的“二年生种子”，而且在自然状态下，即使经过了长时间休眠，重楼种子的出苗率也不高，因此目前仅靠重楼种子进行有性繁殖已无法满足重楼植物大面积栽种的需要。

植株胚状体是由构成植物体的细胞在组织培养条件下，通过类似于受精卵形成的合子发育成胚的过程而形成的体细胞胚体。胚状体具有植物胚的特性，在条件允许的情况下可快速生长为再生植株，可有效解决重楼种苗短缺的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以重楼芽轴为外植体的胚状体诱导方法，该方法诱导产生的胚状体，在适当的条件下可快速生长为再生植株，从而可实现重楼再生植株的快速繁殖。

本发明提供的以重楼芽轴为外植体的胚状体诱导方法包括下列步骤：

（1）取重楼根茎上生长健壮、且未萌发的芽体，先用自来水冲洗干净后阴干，然后进行消毒处理，接着用无菌水震荡洗涤后，用已灭菌的滤纸反复吸干芽体表面的水分，然后接种于预培养基MS+6-BA0.5～3.0mg·L^-1+水杨酸20～80mg·L^-1中，在培养温度为16～22℃、每天光照6～14小时、光照强度为1000～2000lx的条件下进行预培养；

（2）选取预培养后体积明显膨大的芽体，在超净工作台上先将芽鞘切去，然后将芽轴进行纵切，将切开的芽轴的纵切面接入愈伤化诱导培养基MS+6-BA0.5～2.0mg·L^-1+NAA0.5～2.0mg·L^-1+2，4-D1.0～4.0mg·L^-1中，在培养温度为12～26℃、每天光照4～16小时、光照强度为1000～2000lx的条件下进行培养；

（3）将由芽轴产生的已愈伤化的组织切成1～3cm³的大小接入LS+6-BA0.5～2.0mg·L^-1+NAA0.5～4.0mg·L^-1培养基中，在培养温度为16～28℃、每天光照8～12小时、光照强度为1200～2500lx的条件下进行培养，培养25～45天继代一次，连续进行2～4次继代培养，获得重楼胚性组织；

（4）将重楼胚性组织切成0.5～2.5cm³的大小接入LS+6-BA2.0～4.0mg·+IAA0.5～2.0mg·L^-1+头孢噻肟钠100～400mg·L^-1培养基中，在培养温度为5～10℃、每天光照2～6小时、光照强度为400～1000lx的条件下进行培养，培养50～70天后，在胚性组织表面产生白色圆球形的胚状体。

上述所有培养基还包括琼脂5.0～7.0g·L^-1和蔗糖20～60g·L^-1，培养基的pH值为5.6～6.5、

上述步骤（1）中所述消毒处理是指在超净台上先用浓度为70%～75%的酒精消毒10～60s，再用浓度为0.1%～0.15%的升汞消毒4～10min。

本发明首次提出了以重楼芽轴为外植体的胚状体诱导方法,该方法在一定程度上解决了重楼植物大规模栽种时对种源需求的问题，为重楼优良品种的培育和组培苗的大量快速繁殖提供了一条新途径，可实现重楼短时间、低成本、大批量生产。

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

实施例1